组织工程神经导管研究进展

【摘要】 神经导管作为桥梁，连接受损神经，在神经再生与修复过程中起到重要作用。本文对近年来文献报道的神经导管进行归纳，从结构与功能构建方面，综述神经导管的研究进展。

【关键词】 组织工程；神经修复；神经导管

doi：10.3969/j.issn.1004-7484（s）.2013.11.846 文章编号：1004-7484（2013）-11-6819-02

神经损伤是临床上常见的疾病，短段神经缺损可以采用吻合手术进行治疗，然而，长段的神经缺损则需要寻求神经替代物进行移植手术了。于是，神经导管构建一直是神经再生修复领域的研究热点。神经导管的构建经历了由结构到功能的发展。在宏观结构方面，神经导管由单通道发展成为多通道，并在空心通道中填充适合神经再生的材料，增强神经再生能力；在微观结构方面，由多孔结构发展成为纳米纤维仿生结构；在功能方面，由生物学惰性的神经导管，逐渐发展成为负载生物学信号的神经导管。将神经导管与具有生物学活性、促进神经生长的因子、短肽、蛋白质等复合，或者将神经导管与促进神经再生的功能细胞（如血旺细胞等）复合，使得神经导管具有一定的生物学活性，引导和促进神经的再生。

1 单通道中空神经导管

中空管状结构或者多孔棒状结构的支架是神经导管的雏形，这些支架的制备工艺简单。显然，多孔棒状结构支架不适合在体内用做神经再生修复，逐渐退出历史舞台。但是，管状的神经支架，也就是神经导管，一直沿用至今。对于热稳定性好的天然或者合成类材料，可以直接采用熔融浇筑的方法制备单通道神经导管[1]；对于热稳定性差的聚合物，可以选择合适溶剂，采用旋涂的方法，结合空气干燥，制备单通道神经导管，另外，还可以通过电纺丝、相分离等常用方法制备神经导管。不同的原材料或者制备工艺会对神经导管的物理化学性能产生影响。

用京尼平交联明胶，制备单通道神经导管。将这种神经导管用于修复大鼠10mm坐骨神经缺损，6周内，导管未发生明显降解，机械性能稳定，6周后，组织学染色观察到缺损处出现大量被血旺细胞包裹还未形成髓鞘的神经纤维，8周后，电生理实验表明大鼠运动能力有一定程度的恢复。

目前，单通道中空神经导管已经投入临床使用。但是，临床研究发现，由于导管通道直径相对较大，可能导致同一运动神经元再生的轴突在管内发生分支，不利于神经再生[2]。所以，单通道中空神经导管通常用于小于30mm的短段神经损伤治疗。为了治疗长段神经缺损，需要对神经导管的结构与功能设计进行改进。

2 多通道神经导管

多通道神经导管是对单通道神经导管的改进，它将直径较大的单一通道改进为多个直径较小的通道，模仿神经束的结构，为神经生长提供向导。一般情况下，要结合模具的设计，利用注塑成型技术制备多通道神经导管。通道数目以及通道直径等参数，可以通过模具的设计来进行调控。Ruiter等研究表明，多通道神经导管可以在一定程度上减小再生神经的分散性。但是，相对于单通道神经导管，多通道神经导管并没有体现出显著性的神经修复优势。这说明多通道神经导管的通道数与通道直径需要进一步设计完善，使之与实际神经束的尺寸相近。显然，这有待于模具设计与制备工艺的提高。

用EDC与NHS交联胶原制备单通道与不同通道数的多通道神经导管，并于市售的胶原神经导管NeuraGen做比较，在体外，研究它们的力学强度、降解性能以及细胞相容性；在体内，修复大鼠10mm长坐骨神经缺损。动物实验结果表明，单通道和4通道神经导管的神经再生修复能力优于其它实验组别导管；相对于单通道神经导管，2通道和4通道神经导管在达到修复要求的情况下，明显降低了再生神经的分支现象，这体现出多通道神经导管的潜在应用趋势。

相比单通道神经导管，多通道神经导管具有更高的比表面积，这为细胞的粘附，营养物质的吸附于传输提供了便利，增强了轴突再生的能力；当然，多通道必然带来较多的通道壁，可能在一定程度上降低了导管的通透性。总之，多通道与单通道神经导管在神经修复中的优劣还需进一步证明；通道数目与通道直径大小对神经再生的影响也是一个有待研究的课题。

3 通道内带有填充物质的神经导管

如果缺损相对较短，那么外周神经是可以自我修复的。在修复过程中，神经断裂处会出现纤维蛋白束，以便于血旺细胞的迁移、Bunger带的形成[3]。然后，再生的神经纤维会进入纤维蛋白束中，沿着Bunger带生长，到达断裂远端，达到神经再生的目的。但是，如果缺损相对较长，在没有外源性支持的情况下，纤维蛋白束以及Bunger带的形成就变得困难，再生神经束很难生长到断裂远端。所以，在神经导管管道内部填充一部分生物材料，如纤维、凝胶等，在一定程度上代替纤维蛋白的功能，有利于管道腔体内部血旺细胞的粘附、增殖和迁移，促进轴突再生。

Lundborg等是最早尝试在中空的神经导管内填充丝状或者纤维状材料，改进神经导管功能的研究小组之一。他们在硅神经导管中纵向填充聚酰胺纤维丝，修复大鼠15mm坐骨神经缺损。实验结果表明，相对于中空神经导管，含有填充材料的神经导管更有利于神经再生。自从那时起，合成类以及天然类的纤维填充物被用于改进中空神经导管，优化神经修复。

用蚕丝蛋白制备单通道神经导管，并在导管内部填充不同数量的市售Spidrex蚕丝蛋白纤维。体外实验表明，蚕丝蛋白纤维有利于神经的生长；将这种神经导管用于8mm长大鼠坐骨神经缺损修复实验，结果表明，术后4周，在填充200根蚕丝蛋白纤维的神经导管中再生的神经数量，达到自体神经移植对照组的62%，术后8周，有髓鞘包裹的再生神经数目达到自体神经移植对照组的81%。

此外，组成细胞外基质的蛋白，如层连粘蛋白、纤维蛋白以及胶原，也是优良的神经导管填充物。Matsumoto等用PGA制备内径4mm，长90mm，壁厚50μm的神经导管，并在导管内腔填充长90mm，直径50μm的负载层连粘蛋白的胶原纤维。用这种神经导管修复狗80mm坐骨神经缺损，神经再生与运动功能恢复良好。

然而，这种在导管腔体内填充材料，改进神经导管的方法，也具有一定局限性。在管腔内填充材料，必然会降低管腔内的容积，如果填充材料的密度较大或者填充材料的降解时间与神经再生的速率不匹配，那么，填充材料在一定程度上会阻碍神经再生。因此，应该慎重选择填充材料，并考察填充材料的力学性能、降解时间以及填充材料的使用密度。

4 具有纳米纤维结构的神经导管

细胞外基质组成蛋白的主要形态是直径50至500nm的纤维[4]，细胞的体积约比这些纤维高一至两个数量级，这就使细胞可以在三维环境中同时接触多个纳米纤维形态的蛋白质，确定自体在三维环境中的位置，进行细胞体内外物质交换与反应。神经导管为神经细胞的生长提供微环境，是影响神经再生的重要因素，因此，应该在结构和功能上模仿细胞外基质。为了在结构上仿生，许多研究致力于构建具有纳米纤维结构神经导管。

常用的制备纳米细胞支架的方法主要有三种，自组装、电纺丝和相分离。通过pH值诱导多肽与两亲聚合物自组装，可以制备纳米纤维支架[5]。一些合成共聚物也可以通过自组装得到纳米纤维结构。然而，自组装得到的三维结构不稳定，力学强度差，不易制备神经导管，多数自组装技术制备的支架材料为水凝胶。电纺丝是一种应用广泛的制备纳米纤维支架的方法，选择合适的溶剂，许多天然与合成高分子都可以利用电纺丝技术制备纳米纤维支架用做组织工程方面研究。然而，多数电纺丝制备的支架较薄，在构建复杂3D支架（如神经导管，尤其是多通道神经导管）时有一定的困难。目前，电纺丝制备神经导管，需要将制备的较薄纳米纤维支架与一定厚度的材料复合使用，卷曲制备神经导管，所制备的神经导管也只是在内表面上具有纳米纤维结构，而整个导管并非是由纳米纤维组成。相分离是一种简单有效制备组织工程支架的方法，结合模具设计与低压注塑技术，可以方便快捷的制备各种宏观结构的神经导管。

Chew等人合成己内酯与乙基磷酸酯的共聚物，然后混合人胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）进行电纺丝，制备纤维取向排列的纳米纤维支架，并把支架卷曲，制备得到内壁具有取向纤维的神经导管。用这种神经导管进行大鼠外周神经15mm缺损修复实验，结果表明，神经导管内部纤维取向对大鼠神经再生有影响，平行导管方向的纤维取向有利于神经再生。术后三个月，电生理检测表明，用内部含有平行导管取向纤维且负载GDNF的神经导管修复9只大鼠外周神经缺损，4只大鼠运动功能得到恢复，优于其它各实验组。

5 负载生长因子的神经导管

对于治疗鼠类小于10mm以及灵长类小于30mm的短段外周神经缺损，上述神经导管已经卓有成效。但是，当神经缺损过长时，仅凭改变神经导管的结构很难达到修复的目的，这就需要在神经导管中负载生物学信号来促进长段缺损神经再生。生物学信号可以是由生长因子或者移植细胞提供。

生长因子是细胞分泌的调整细胞增殖和分化的蛋白质或者多肽。神经再生受到细胞、细胞外基质分子以及生长因子的综合影响，其中，生长因子对神经修复尤其重要[6]。与神经再生相关的生长因子包括神经生长因子（Nerve growth factor，NGF），脑源性神经营养因子（Brain-derived neurotrophic factor，BDNF），神经营养因子-3（Neurotrophin-3，NT-3），神经营养因子-4/5（Neutotrophin-4/5，NT-4/5）等[7]。研究表明，神经断裂末端细胞分泌的生长因子可以支持轴突再生，但是，细胞分泌的生长因子含量有限，很难维持持续性供给。所以，神经导管内生长因子的负载与控制释放一直是人们关注的研究课题，意义重大。

已经报道的在神经导管中负载生长因子的方法大致分为以下几种：①直接在神经导管中溶解生长因子；②通过外接注射泵持续供给生长因子；③在制备过程中，将生长因子与制备神经导管的原料混合，制备管壁内包裹生长因子的神经导管；④通过微球负载生长因子于管壁；⑤通过导管内腔填充物负载生长因子[7]；⑥基因表达策略。

用PLGA与PLLA制备负载GDNF的双层微球，再将这些微球复合于PCL神经导管管壁内部，体外实验表明，GDNF的释放可以维持50天以上。用这种神经导管修复大鼠坐骨神经15mm缺损。术后6周，在断裂处近端以及远端，神经再生情况良好，再生的血旺细胞优先生长于管壁负载GDNF微球处，而无GDNF负载的神经导管对照组，基本无血旺细胞再生。

6 负载细胞的神经导管

可以用于神经再生修复的细胞包括血旺细胞和干细胞。血旺细胞是神经胶质细胞的一种，对神经元的生存与功能起着至关重要的作用。在神经受损后，血旺细胞的形态发生改变，形成共轴突再生的管道。血旺细胞可以分泌多种生长因子，如神经生长因子（NGF）、脑源性神经营养因子（BDNF）、胶质源性神经营养因子（GDNF）、胰岛素样生长因子以及促红细胞生长素。此外，血旺细胞还有清理损伤髓鞘碎片的功能。这些性质使得血旺细胞成为在神经修复中使用最多的细胞。将血旺细胞种植于单通道神经导管的空腔内部，或者将血旺细胞种植于多通道神经导管，培养一段时间后，利用负载血旺细胞的神经导管进行外周神经修复，结果表明，这种神经导管可以促进Bunger带的形成，有利于神经再生。

在神经损伤后，由于营养供应不足，大量神经元会死亡，移植神经元于受损神经，在一定程度上可以促进神经损伤修复。然而，成熟神经元本身很难在体外培养增殖，这为神经元的获取带来了不便。随着干细胞研究的兴起，人们发现，干细胞具有无限增殖的能力，在一定的条件可以诱导干细胞分化成为神经元，这为神经元的获得提供了便利。常用的干细胞包括胚胎干细胞（ESCs）、神经干细胞（NSCs）和间充质干细胞（MSCs），它们的来源不同，功能略有差异。

设计模具，用热质相分离法制备了7通道PLGA神经导管，并对其力学性能、降解性质以及生物相容性做了体外研究。Du等人在这种神经导管上种植NSCs，共培养后14天后，用于大鼠脊柱横断修复。术后两周，行为学分析表明，实验组大鼠的运动能力恢复高于对照组，且具有显著性差异；免疫反应分析表明，移植的细胞有较高的存活率，在脊髓损伤处分化成为神经元形貌的细胞，SEM观察也证实了这一点；免疫染色分析表明，实验组神经纤维的再生数量明显高于其它对照组；Nissl染色表明实验组大鼠本体神经元存活率高于其它组别；整个动物学实验表明，这种负载NSCs的PLGA多通道神经导管，在治疗脊髓损伤方面有潜在的应用前景。

7 结 语

神经导管已经广泛应用于长段神经缺损的临床治疗。利用组织工程原理，对神经导管的结构及功能构建进行研究，制备新型神经导管，是神经再生修复领域的重要研究方向。微观结构仿生并且具有一定生物功能的神经导管将在神经治疗领域发挥更重要的作用。

参考文献

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