浅谈胆碱酯酶对分析有机磷农药残留的影响

摘要：本文阐述了目前我国农药残留快速检测技术酶抑制法在使用中存在的问题和解决途径。并采用茭白作为样品对酶抑制法中产生假阳性的因素进行了分析与解决。讨论了对胆碱酯酶活性产生影响并提出了胆碱酯酶的优化反应条件。酶抑制法具有快速、简便、灵敏及低成本等优点，并已成为我国农药残留快速检测的主流技术。

关键词：农药残留 酶抑制法 胆碱酯酶 假阳性

农药残留快速检测技术在我国应用最多的是酶抑制法，利用这一原理生产的各种速测卡、速测仪具有高的专一性、灵敏性和准确性及低成本等优点，正越来越多地进入蔬菜、果品、茶叶等生产基地、农贸市场、超市及监督部门，已成为我国农药残留快速检测的主流技术，是当前和今后一段时期内农产品农药残留快速检测的首选方法之一。

1 材料与方法

1.1 酶抑制法实验原理

在一定条件下，有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶正常功能有抑制作用，其抑制值与农药的浓度呈正相关。正常情况下，酶催化神经传导代谢产物（乙酰胆碱）水解，其水解产物与显色剂反应，产生黄色物质，用分光光度计在412nm处测定吸光度随时间的变化值，计算出抑制值，通过抑制值可以判断出样品中是否有高剂量有机磷或氨基甲酸酯类农药的存在。

1.2 原料 试剂 仪器

原料：茭白冲洗掉表面泥土，剪成1cm见方碎片，取样品1g放入烧杯或提取瓶中，加入5mL缓冲溶液，震荡1min～2min，到出提取液，静置3min～5min，待用。

试剂：①pH8.0缓冲溶液；②显色剂：分别取160mg二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）和15.6mg碳酸氢钠，用20mL缓冲溶液溶解，4℃冰箱中保存；③底物：取25.0mg硫代乙酰胆碱，加3.0mL蒸馏水溶解，摇匀后置4℃冰箱中保存备用。保存期不超过两周；④乙酰胆碱酯酶：用缓冲溶液溶解，3min的吸光度变化ΔA0值应控制在0.3以上。摇匀后4℃冰箱中保存备用。保存期不超过4天。

仪器：农药残留测定仪（博纳CL-BIII）。

1.3　实验方法

①对照溶液测试：先于试管中加入2.5mL缓冲溶液，再加入0.1mL酶液、0.1mL显色剂，摇匀后于37℃放置15min以上（每批样品的控制时间应一致）。加入0.1mL底物摇匀，此时检液开始显色反应，应立即放入仪器比色池中，记录反映3min的吸光度变化值ΔA0。

②样品溶液测试：先于试管中加入2.5mL样品提取液，其它操作与对照溶液测试相同，记录反映3min的吸光度变化值ΔAτ。

抑制值（%）=[（ΔA0-ΔAτ）/ΔA0]×100

式中：ΔA0—对照溶液反应3min吸光度的变化值。

ΔAτ—样品溶液反应3min吸光度的变化值。

③结果判定：

结果以酶被抑制的程度（抑制值）表示。

当蔬菜样品提取液对酶的抑制值≥50%时，表示蔬菜中有高剂量有机磷或氨基甲酸酯类农药存在，药品为阳性结果。阳性结果的样品需要重复检验两次以上。

对阳性结果的样品，可用其它方法进一步确定具体农药品种和含量。

2　实验结果

2.1　样品处理方法对抑制值的影响

将样品茭白采用两种不同的方法进行处理。第一组样品剪切浸泡处理后进行检测，第二组则整株浸泡后检测。

实验数据结果显示剪切浸泡的样品提取液对酶的抑制值大于50%，呈阳性，而整株浸泡的样品提取液对酶的抑制值则小于50%，将数据结果进行方差分析得到F=19.30169>F（0.05）=7.70865有显著性差异，说明处理方法的不同对样品的抑制值是有影响的。见表1。由于样品剪切浸泡后使样品组织内部的植物次生物质渗透出来抑制了酶的活性，使样品提取液对酶的抑制值增大，造成假阳性结果，因此在进行农药残留检测的操作上应采取不剪切的方法，谨防假阳性结果的产生。

2.2　浸泡时间对抑制值的影响

将样品茭白整株浸泡在缓冲液中，分别浸泡0h、2h、4h、6h、8h后进行检测。

数据结果显示随着浸泡时间的延长，样品茭白提取液对酶的抑制值也随之增大，但在4h的时候其抑制值达到顶峰值，随后抑制值则随时间的递增而减小。见图1。

将数据结果进行方差分析得到F=7.109094>F（0.05）=3.47805有显著有显著性差异，说明浸泡时间对茭白的抑制值有影响。见表2。

3　结论

通过筛选获得了胆碱酯酶的优化反应条件，即2.5mL（pH8.0）缓冲液（无水磷酸氢二钾和磷酸二氢钾混合水溶液），0.1mL显色剂（二硫代二硝基苯甲酸[DTNB]和碳酸氢钠混合水溶液），0.1mL酶液（乙酰胆碱酯酶），在37℃下保温15min以上，加入0.1mL的底物（硫代乙酰胆碱水溶液），测定波长为412nm，测定时间为3min。检测结果还表明乙酰胆碱酯酶对有机磷十分敏感，可用于农产品中农药残留监测。

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