银杏叶提取物对同型半胱氨酸诱导HUVECs凋亡中JNK表达的影响

摘 要:目的:研究银杏叶提取物(EGb)对同型半胱氨酸诱导人脐静脉内皮细胞(huvecs)JNK表达的影响。方法:在人脐静脉内皮细胞培养基中加入不同浓度Hcy培养24h,以及加入EGb预处理再加入10.0mmol/L的Hcy作用2h。用TUNEL法检测HUVECs凋亡情况。用Western-Blot法检测不同组HUVECs表达P-jnk的蛋白含量。结果:用0.3mmol/L的Hcy干预后,HUVECs凋亡和JNK表达开始高于对照组(P

关键词:同型半胱氨酸;内皮细胞;c-Jun氨基末端激酶;银杏叶提取物

中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1673-7717(2010)01-0176-04

The Effects of EGb in the Expression of JNK on Apoptosis of HUVECs Induced by Homocysteine

YE Xiaojun1,FENG Yan1,WANG Xiaotong2,HE Zhiyong2,HUANG Hanjin2

(1.Affiliated Hospital of Hangzhou Normal University,Hangzhou 310015,Zhejiang,China;

2.Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College,Wenzhou 325027,Zhejiang,China)

Abstract:Objective: To explore the effects of EGb in the expression of JNK on apoptosis of HUVECs induced by homocysteine.Methods: The HUVECs were treated with the different concentration of Hcy for 24 hours. Before HUVECs were treated with 10.0mmol/L Hcy,they were treated with the concentrations of EGb mentioned above for 2 hours. Cell apoptosis was detected by TUNEL method.P-JNK was detected by western blot in different HUVECs.Results:After exporsure of theHUVECs to Hcy at the concentration of 0.3mmol/L(P

Key words:homocysteine;endothelial cell;c-Jun-N-terminal kinase;atherosclerosis; extract of ginkgo biloba

近来研究表明血浆Hcy水平升高是冠心病、脑血管疾病以及外周阻塞性血管疾病等心脑血管疾病的一个重要独立危险因素[1]。有研究认为Hcy可以损伤血管内皮促进动脉粥样斑块形成[2];体外细胞培养显示Hcy能诱导内皮细胞凋亡[3],而目前有关Hcy诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)凋亡的具体机理尚不明确。银杏叶提取物(extract of ginkgo biloba,EGb)是我国传统中药,具有较强的清除自由基、降低血液黏度、延长凝血时间等和抗凋亡的作用,目前关于EGb抗凋亡分子研究报道较少。本实验通过对HUVECs的培养,进一步验证Hcy诱导HUVECs的凋亡以及JNK的表达,并且应用EGb进行干预以及JNK表达的检测,初步探讨JNK信号通路是否为EGb抑制Hcy诱导HUVECs凋亡可能分子作用机制之一。

1 材料与方法

1.1 材料

人脐静脉内皮细胞细胞株(Human Umbilical Veins Endothelial Cells Line,HUVECs)购于上海坤肯特生物技术有限公司。同型半胱氨酸(美国Sigma公司)和RPMI1640培养基(美国GBICO公司),EGb(美国Biomol公司)与胰蛋白酶和EDTA混合液(美国GBICO公司),胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司),Tunel法凋亡检测试剂盒(美国Roche公司),兔抗人P-JNK1/2、JNK1/2多克隆抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗(美国Cell Singnal Technology公司),BCA蛋白定量试剂盒、增强的化学发光检测试剂盒(美国Piece公司)。

1.2 实验方法

人脐静脉内皮细胞的培养和传代方法见文献[4],实验采用3～5代的细胞。

将HUVECs按1×105/mL的密度接种于含有盖玻片的6孔板内进行爬片培养,用含10%FBS的RPMI1640培养液培养,待细胞长至盖玻片50%的时候,改换成用无血清的培养基继续培养24h,细胞饥饿24h,使细胞同步化于G0 期(细胞同步化)后,加入下列实验组:A组(正常对照组)、B组(Hcy 0.1mmol/L)、C组(Hcy 0.3mmol/L)、D组(Hcy 1.0mmol/L)、E组(Hcy 3.0mmol/L)、F组(Hcy 10.0mmol/L)、EGb1(Hcy 10.0mmol/L+EGb12.5μg/mL)组和EGb2(Hcy 10.0mmol/L+EGb25.0μg/mL)组,各组细胞设立3个复孔。

1.3Tunel细胞凋亡检测按试剂盒说明进行

苏木素复染后封片,在光镜下分析结果。细胞核内见到棕褐色颗粒为凋亡阳性细胞。在显微镜下每组随机取3～5个不同视野,计算各个视野细胞凋亡指数(apoptosis index)=TUNEL阳性细胞数/总细胞数×100%,再取其均数作为该组细胞凋亡指数。

1.4Western Blot检测不同浓度Hcy刺激下P-JNK时间动态变化

实验组测定2个浓度Hcy(0.1、10.0 mmol/L)刺激下,P-JNK随时间的动态变化,观察其趋势是否相同。实验过程如下:同步化和洗涤后的细胞,加入0.1 mmol/L或者10.0 mmol/LHcy刺激,分别在刺激后0、15、30、1、2、4、8h,取出6孔板,提取细胞总蛋白,用BCA法测定总蛋白浓度,将每组总蛋白浓度稀释成1.0mg/mL,每组加入2×SDS上样缓冲液混合,沸水浴中加热5min变性,冰上骤冷,样品于聚丙烯酞胺凝胶电泳分离蛋白,然后电转移至PVDF膜上,5%脱脂牛奶室温封闭1h,孵育塑料小盒中加入5%牛血清白蛋白稀释的兔抗人P-JNK多克隆抗体(1∶1000)或兔抗人JNK多克隆抗体(1∶1000),4℃过夜,5%牛血清白蛋白稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗(1∶1000),室温2h,膜于增强发光检测试剂(试剂A:试剂B=1∶1)反应5min,取出膜,甩去多余的检测试剂,保鲜膜包好NC膜,曝光,显影,定影。LISCAP CAPTURE凝胶照相分析软件分析P-JNK及JNK光密度值,两者均以对照组样品的光密度值为参照(定为1),以此来标准化其他条带的光密度值,再以JNK1/2光密度值来标准化P-JNK1/2光密度值,即以P-JNK光密度值/JNK光密度值的比值代表样品P-JNK的光密度。

1.5Western Blot检测不同浓度Hcy刺激下P-JNK的表达

实验组测定5组不同浓度Hcy(0.1、0.3、1.0、3.0、10.0mmol/L),不同浓度EGb(12.5μg/mL、25.0μg/mL)预处理后Hcy刺激下,P-JNK水平的变化,同步化和洗涤后的细胞,在上述浓度的Hcy刺激2h后[5],取出6孔板,提取细胞总蛋白,用于Western Blot检测P-JNK水平,每组设3孔。

1.6统计学处理

全部数据经SPSS 11. 0统计软件进行分析,数据以均数±标准差(±s)表示,多组比较采用单因素方差分析,两两比较方差齐者用LSD检验,方差不齐者用Dunnett’T3检验。

2 结 果

2.1TUNEL方法检测不同浓度Hcy及EGB对HUVECs凋亡的影响 TUNEL阳性细胞表现为细胞核内见到棕褐色颗粒,结果显示细胞凋亡指数随着Hcy浓度增加而升高,0.3mmol/L Hcy即可以引起凋亡指数明显升高,与对照组比较有显著性差异(P

2.2Western Blot检测各实验组JNK磷酸化变化比较

2.2.1 Hcy刺激下JNK1/2随时间的动态变化

两种浓度Hcy刺激下,P-JNK1/2随时间的动态变化趋势较为相似:各实验组的P-JNK1/2水平均高于对照组(Con组,看成零时刻),差异有统计学意义(P

2.2.2 不同浓度Hcy刺激下P-JNK的动态变化研究结果显示:各浓度实验组(分别0.1、0.3、1.0、3.0、10.0mmol/LHcy)刺激P-JNK1/2均高于对照组,差异有显著性(P

2.2.3不同浓度EGb对10.0mmol/LHcy刺激下的JNK磷酸化水平的影响 研究显示:10.0mmol/LHcy刺激下P-JNK较对照组(Con组)明显升高(P

3 讨 论

Hcy是近几年来倍受关注的可能是动脉粥样硬化独立危险因素之一,它可以通过损伤内皮细胞引起细胞凋亡、促进炎症介质释放和平滑肌细胞增殖、破坏凝血功能平衡等多方面引起动脉粥样硬化的发生和发展[6]。而内皮细胞异常与动脉粥样硬化关系密切,Harker等认为内皮细胞结构和功能上的损伤能启动动脉粥样硬化发生,并促进其发展。而EGb脑保护作用的机制目前明确的有两个方面: 一方面通过拮抗血小板活化因子( PAF) ,减轻脑缺血时PAF所造成的损伤;另一方面能清除体内自由基,产生抗氧化作用,减轻脑缺血时体内产生的过多自由基对脑组织造成的损伤[7]。EGb是否对Hcy诱导HUVECs凋亡有保护作用目前报道不多。

本实验采用TUNEL方法检测Hcy对HUVECs的毒性作用,结果显示低浓度的Hcy即可导致细胞凋亡,但是细胞凋亡率提高不明显,与对照组相比差异没有显著性,但是随着Hcy浓度增加,细胞凋亡率明显升高,本实验进一步证实细胞凋亡可能是Hcy对HUVECs的毒性作用机制之一。实验结果还显示Hcy对HUVECs的毒性作用可能是浓度依赖关系。而先给予EGb预处理后,再加入高浓度的 Hcy继续培养发现细胞凋亡有所减少,而且以高浓度EGb时减少细胞凋亡为甚,说明EGb可能抑制Hcy诱导的HUVECs凋亡作用。由于细胞坏死后可以出现少量3-OH末端,因此坏死细胞也可能出现阳性反应,使细胞凋亡比率高于实际水平,这些有待以后实验中进一步完善。

以往研究证实在真核细胞中有4条MAPK信号转导通路,即细胞外调节蛋白激酶(extra cellular regulated protein kinases,ERK)通路、JNK通路、P38通路及ERK5通路[8]。JNK信号通路是MAPK中重要的通路之一,它位于胞质、分子质量为54kD的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。JNK包含双磷酸化功能区Thr-Pro-Tyr,与c-Jun N端的活化区结合并使其第63、73位丝氨酸残基磷酸化,JNK的活化是通过其氨基酸残基磷酸化,一旦被激活,胞浆内的JNK移位到细胞核而发挥作用[9]。本实验在离体外对HUVECs模拟高同型半胱氨酸血症诱导内皮细胞凋亡,初步探讨JNK磷酸化在Hcy诱导HUVECs凋亡中的作用。为求证这一设想,本实验通过高低不同的两种不同浓度的Hcy作为刺激因子,检测不同时间下JNK磷酸化水平的变化,确定最佳提取蛋白时间为2h左右,国外研究与本结果基本一致[5]。然后用不同浓度下Hcy刺激HUVECs,观察其JNK磷酸化水平的变化,本实验结果证实Hcy诱导HUVECs凋亡时,不同Hcy浓度诱导HUVECs凋亡时均引起JNK磷酸化,而且不同浓度Hcy促进JNK磷酸化水平呈线性关系(P

显抑制JNK磷酸化,高浓度的EGb时更为明显,与最高浓度Hcy组的P-JNK水平相比具有明显的抑制作用(P

参考文献

[1] Christen WG,Ridker PM. Blood levels of homocysteine and atherosclerotic vascular disease[J].Curr Atheroscler Rep,2000,2(3):194-199.

[2] Matthias D,Becker CH,Riezler R,et al. Homocysteine induced arteriosclerosis-like alterations of the aorta in normotensive and hypertensive rats following application of high doses of methionine[J].Atherosclerosis,1996,122(2):201-216

[3] Suhara T,Fukuo K,Yasuda O,et al. Homocysteine enhances endothelial apoptosis via upregulation of Fas-mediated pathways[J].Hypertension,2004,43(6):1208-1213.

[4] 何志勇,张雄,王小同.叶酸拮抗同型半胱氨酸诱导的内皮细胞凋亡的作用机制[J].中国病理生理杂志,2007,23(4):699-701.

[5] Hayashida T,Poncelet AC,Hubchak SC,et al. TGF-β1 activates MAP kinase in human mesangial cells: a possible role in collagen expression[J].Kidney Int,1999,56(5):1710-1720.

[6] Zeng XK,Remick DG,Wang X.Homocysteine induces production of monocyte chemoattractant protein-1 and interleukin-8 in cultured human whole blood[J]. Acta Pharmacol Sin,2004,25(11):1419-1425.

[7] 李茯梅,段小毛,王俊杰,等.银杏叶提取物对脑缺血再灌注大鼠线粒体ATP敏感性钾通道的影响[J].中华中医药学刊,2008,26(7):1462-1463.

[8] Li BS,Wang J,Zeng YJ,et al. Exterimental study on serum fibrosis markers and liver tissue pathology and hepatic fibrosis in inmuno-damaged rats[J].Word J Gastroenterol,1999,7(12):1031-1034.

[9] Abe J,Baines CP,Berk BC. Role of mitogen-activated protein kinases in ischemia and reperfusion injury: the good and the bad[J]. Circ Res,2000,86(6):607-609.