中药生物药剂学分类系统中多成分环境对葛根素溶解度的影响

[摘要] 该研究针对中药生物药剂学分类系统（biopharmaceutics classification system of Chinese materia medica， CMMBCS）中的溶解度问题，实验考察人工制造的多成分环境对溶解度的影响，并利用所获数据进行数学建模总结相关规律。实验采用递进式设计，分别研究了单一成分背景（黄芩苷、小檗碱和甘草酸）、两成分背景（黄芩苷+甘草酸、黄芩苷+小檗碱和甘草酸+小檗碱）和三成分背景（黄芩苷+甘草酸+小檗碱）对葛根素溶解度影响的变化趋势，从而建立多成分环境对葛根素溶解度影响的数学回归模型方程。

[关键词] 中药生物药剂学分类系统;多成分环境;溶解度;葛根素;数学建模

[收稿日期] 2014-07-18

[基金项目] 国家自然科学基金项目（81473362）;北京中医药大学创新团队发展计划项目（2011-CXTD-13）

[通信作者] *董玲，副研究员，硕士生导师，主要从事新剂型给药系统研究，Tel：（010）64286245，E-mail：;*张强，助理实验师，主要从事中药制剂分析研究，Tel：（010）84738629，E-mail：

[作者简介] 侯成波，硕士研究生，E-mail：

中药生物药剂学分类系统中，对溶解性的评价，一定要注重成分所处的多成分环境，在多成分环境中呈现的溶解度才是CMMBCS的真正分类依据。无论何种药物，其成分只有在溶解状态才能被吸收，在肠液中溶解度较差的药物，肠道内的吸收就被限制[1]。单一成分溶解度的研究已经有了较成熟的研究方法与评价体系，而对于多成分的中药，其多成分环境下药物的溶解度值得深入研究。因此，本研究选取中药复方中的高含量成分（对环境影响大）设计人工多成分环境，通过递进式实验采集实验数据，进而用所获数据数学建模，总结多成分环境对葛根素溶解度影响的规律。

本研究基于经方葛根芩连汤（葛根、黄芩、黄连和甘草组成），以葛根素为研究对象，选择复方中其余3味药的高含量成分黄芩苷、小檗碱和甘草酸人工设计葛根素溶解度研究的多成分环境，用于数据采集。借鉴化学药品的溶解度实验基本方法，采用递进式的实验流程，依次实验考察黄芩苷、甘草酸和小檗碱各单一成分、任意两成分组合和全部三成分背景下的葛根素的溶解度，并用实验所获数据建模。

1 材料与试剂

1.1 仪器

Waters液相色谱系统（600四元泵，美国Waters公司），2487双波长紫外检测器，Empower 2工作站;电子分析天平（BT-25S，北京赛多利斯仪器有限公司）;pH酸度计（FE20，梅特勒-托利多仪器上海有限公司）。

1.2 药物

葛根素对照品（批号110752-200912，中国食品药品检定研究院）;葛根素原料（批号120504，陕西中鑫生物技术有限公司）;黄芩苷原料（批号ZL-A-018，南京泽朗医药科技有限公司）;盐酸小檗碱原料（批号120212，陕西中鑫生物技术有限公司）;甘草酸单铵原料（批号GU20120611，武汉金诺化工有限公司）。

1.3 试剂

乙腈购买于美国Fisher公司（色谱级）;磷酸购买于北京化工厂（分析级）;娃哈哈纯净水购买于娃哈哈集团公司（中国杭州）。盐酸、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氢氧化钠、一水枸橼酸、磷酸氢二钠（均购自北京化工厂）等试剂都为分析纯。

2 方法

2.1 不同pH缓冲液的配制

pH 1.0盐酸溶液配制：量取盐酸溶液9 mL，加水稀释至1 000 mL，即得。pH 4.0缓冲液配制：取一水枸橼酸12.90 g，取磷酸氢二钠27.25 g，加水1 000 mL溶解，即得。pH 6.8缓冲液配制：取磷酸二氢钾1.70 g和磷酸氢二钾1.78 g，加水溶解稀释至1 000 mL，即得。pH 7.4缓冲液配制：取磷酸二氢钾6.81 g，加0.1 mol・L-1氢氧化钠溶液395 mL稀释至1 000 mL，即得。

2.2 对照品溶液制备

精密称取葛根素对照品10 mg，置100 mL量瓶中加入不同的溶出介质适量，置超声仪中使完全溶解，加溶出介质至刻度，摇匀，制成质量浓度约为0.1 g・L-1的对照品溶液。

2.3 色谱方法

Phenomenex Luna C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流速1.0 mL・min-1;检测波长250 nm;柱温30 ℃;进样量20 μL;流动相0.05%磷酸溶液-乙腈（82∶18）。

2.4 葛根素溶解度研究[2]

2.4.1 葛根素在不同pH缓冲液中溶解度研究 精密称取葛根素200 mg，分别加入pH为1.0，4.0，6.8，7.4的缓冲液10 mL，混合均匀，置于37 ℃水浴，每5 min震摇30 s，30 min后取出，静置10 min，取上清液，稀释至适宜浓度后过0.45 μm滤膜，进行HPLC分析。

2.4.2 葛根素单成分及两成分背景中溶解度研究 精密称取葛根素200 mg，加入不同配比黄芩苷、小檗碱及甘草酸，同2.4.1项描述方法进行溶解度考察。单一成分背景配比：黄芩苷加入比例：30%，50%，80%，100%，120%，150%;小檗碱加入比例：低浓度区域2%，4%，6%，8%，10%;高浓度区域12%，15%，20%，30%，40%，50%，60%，100%;甘草酸加入比例：10%，30%，50%，80%，100%，120%，150%，200%。两成分背景配比：黄芩苷+甘草酸加入比例：25%+25%，60%+25%，25%+60%，25%+75%，75%+25%，75%+75%，60%+60%，100%+60%，60%+100%;黄芩苷+小檗碱加入比例：6%+100%，30%+100%，100%+100%，60%+60%，6%+10%，10%+6%，30%+2%，30%+10%，60%+6%，100%+10%;甘草酸+小檗碱加入比例：10%+100%，30%+60%，80%+100%，30%+6%，10%+10%，80%+2%，80%+10%，100%+60%，100%+6%，150%+100%，150%+10%。

2.4.3 三成分背景中葛根素溶解度研究 为系统研究黄芩苷、甘草酸和小檗碱对葛根素溶解度的影响趋势，选择响应曲面方法（response surface methodology，RSM）对输出变量（葛根素溶解度）和因素之间（加入成分比例）的非线性关系进行准确的评估。以响应曲面方法中的不旋转中心复合设计（central composite design，CCD）实验，根据上述已完成试验的初步结果，选择黄芩苷加入比例（X1）、甘草酸加入比例（X2）和小檗碱加入比例（X3）为考察因素，其水平范围分别为：X1：6%～80%;X2：10%～80%;X3：2%～60%，实验设计的代码水平见表1，2。

表1 CCD实验设计因素水平表

Table 1 The factor level table of CCD experimental design

水平黄芩苷加入比例

/%甘草酸加入比例

/%小檗碱加入比例

/%

-16102

0434531

+1808060

表2 CCD设计实验安排表

Table 2 The schedule of CCD experimental design

No.模式黄芩苷加入

比例/%甘草酸加入

比例/%小檗碱加入

比例/%葛根素溶解度

/g・L-1

10--645318.93

2+0-80806012.58

3043803111.56

40+-4345608.89

5++0680607.99

6-0-80453111.76

70-+8010609.43

8+0+610606.11

9-+08080212.01

10--068028.83

11+-04345211.75

120++43453110.36

13-0+4310319.76

14---61029.30

15+--8010212.01

2.5 数学模型建立方法[3]

2.5.1 葛根素多成分环境下溶解度单元模型建立 以葛根素溶解度研究中不同成分加入比例作为过程输入变量，以葛根素的溶解度作为结果输出变量，建立相应的研究模型。并以方程拟合优度参数对模型性能进行检验。采用全项二次多项式方法，建立回归模型，基于OLS进行数据模型参数估计与计算。方程的拟合优度检验主要是以均方根误差（root mean square error，RMSE）和决定系数R2作为方程拟合优度的评价，RMSE越接近于0，R2越接近于1，方程拟合质量越高。主要算法及自适应建模均由JMP pro10.0平台实现。

2.5.2 葛根素多成分环境下溶解度组合模型建立 在进行单元建模时发现不同的化学环境对葛根素溶解度的影响变化较大，不同的加入成分其自身处于不同化学环境时，其表现出对葛根素溶解度的影响程度也会发生变化，也就是说输出变量变化的同时，自变量效应大小会因为自变量的组合方式不同而发生改变。基于这种情况，有必要对上述单元建模的数据进行系统汇集，进行单元组合建模，这样不仅能简化预测方程数量，同时能将上述所阐述的各种变化的信息融合到一个数据模型中，能实现更准确地用一种模型去预测多成分对葛根素溶解度的影响。对不同成分配比背景下葛根素溶解度单元模型的数据进行系统汇集，进行单元组合建模，以黄芩苷、甘草酸和小檗碱加入比例作为过程输入，以葛根素溶解度作为过程输出，对此过程采用回归模型（OLS）、高斯过程（GPR）[4]、神经网络（ANN）3种建模方法，建立相应的模型，并以RMSEC，RMSEP，AAEC，AAEP和决定系数R2对各模型的性能进行评价。

3 结果

3.1 葛根素在不同pH缓冲液中的溶解度研究

葛根素属于弱酸性化合物，在不同pH背景下溶解度不同，对葛根素在不同pH缓冲液中溶解度研究实验表明，葛根素的溶解度在pH 1.0盐酸溶液中为3.38 g・L-1，在其他缓冲溶液中，随着pH增加，当pH小于4.0时，葛根素的溶解度基本达平，不再随着溶液pH的变化而变化。在pH 4.0～7.4有规律增加，并在pH 7.4缓冲液溶解度最大，达到7.56 g・L-1，见图1。

图1 葛根素在不同pH缓冲液中溶解度

Fig.1 The solubility of puerarin in different pH

3.2 单一成分背景对葛根素溶解度影响研究

加入不同比例的黄芩苷均能增加葛根素在pH 7.4缓冲液中的溶解度，并且随着黄芩苷加入比例的增加，葛根素的溶解度逐渐增加;加入不同比例的甘草酸均能增加葛根素在pH 7.4缓冲液中的溶解度，随着甘草酸加入比例的增加，葛根素的溶解度逐渐增加;并且在甘草酸加入量为50%～150%，甘草酸对葛根素溶解度的影响呈现明显的线性关系，决定系数R2为0.990 9;加入小檗碱时，在低浓度区域（小于10%）可以增加葛根素的溶解度，在高浓度区域（10%～100%），可以降低葛根素的溶解度，见图2。

A.黄芩苷;B.甘草酸;C.小檗碱（低浓度区域）;D.小檗碱（高浓度区域）。

图2 不同比例黄芩苷、甘草酸、小檗碱对葛根素溶解度影响趋势

Fig.2 The influence trend of baicalin， glycyrrhizic acid， berberine on the solubility of puerarin

采用Excel 2010 对上述数据进行一元三次多项式回归模型拟合，如一元三次多项式回归方程为Y=b0+b1X+b2X2+b3X3，其中甘草酸加入量在50%～150%，由于具有良好的线性关系，此区域单独采用一元线性拟合，具体的拟合方程见表3。

表3 溶解度试验数据拟合方程

Table 3 Fitting equation of solubility test data

葛根素溶解度方程拟合方程R2

黄芩苷Y=2.394 6X3-8.557 6X2+10.879X+7.771 50.998 6

甘草酸Y=-1.629X3+5.360 3X2-1.064 1X+8.001 50.991 5

Y=4.667 3X+6.009 9（线性方程）0.990 9

小檗碱Y=3.075X3-9.762X2+3.299 9X+7.853 6（高浓度）0.997 4

Y=1 048.7X3-528.21X2+58.708X+7.765 4（低浓度） 0.915 6

3.3 两成分背景对葛根素溶解度的影响研究

在研究两成分同时存在的化学背景下，二者联合作用对葛根素溶解度的影响趋势见图3。以葛根素溶解度研究中不同成分加入比例作为过程输入变量，以葛根素的溶解度作为结果输出变量，建立相应的研究模型。并以方程拟合优度参数对模型性能进行检验。采用全项二次多项式方法，建立回归模型，基于OLS进行数据模型参数估计与计算。

A.黄芩苷+甘草酸;B.黄芩苷+小檗碱;C.小檗碱+甘草酸。

图3 不同比例两成分背景对葛根素溶解度影响

Fig.3 The influence trend of two component environment on the solubility of puerarin

3.3.1 葛根素中加入不同比例黄芩苷和甘草酸溶解度模型 Y=8.259+3.900X1+3.997X2-2.925（X1-0.505）×（X2-0.505），由模型方程的评价结果可知，模型方程的RMSE为0.858 5，决定系数R2为0.902 8，该模型方程可以解释样本中约90%的数据，可解释能力较强。

3.3.2 不同比例黄芩苷和小檗碱对葛根素溶解度影响模型 Y=7.953+3.584X1-4.537X2+1.770（X1-0.392 73）×（X2-0.367 27），由模型方程的评价结果可知，模型方程的RMSE为0.288 2，决定系数R2为0.987 9，该模型方程可以解释样本中约98%的数据，符合要求。

3.3.3 不同比例甘草酸和小檗碱对葛根素溶解度影响模型 Y=7.390+3.949X1-2.933X2+3.013（X1-0.683 3）×（X2-0.386 7），由模型方程的评价结果可知，模型方程的RMSE为0.910 8，决定系数R2为0.904 5，该模型方程可以解释样本中约90%的数据，符合要求。

3.4 三成分背景对葛根素溶解度的影响研究

在研究黄芩苷、甘草酸和小檗碱同时存在的化学背景下，三者联合作用对葛根素溶解度影响建模时，发现三者对葛根素溶解度影响程度差别较大，呈现出黄芩苷>小檗碱>甘草酸的特征，甘草酸和小檗碱具有交互作用。以葛根素溶解度研究中黄芩苷、甘草酸和小檗碱加入比例作为过程输入变量，以葛根素的溶解度作为输出变量，建立相应的研究模型为：Y=8.972+5.006X1+1.146X2-3.170X3-5.764（X2-0.45）×（X2-0.45）+8.18（X2-0.45）×（X3-0.31），模型方程的RMSE为0.401 8，决定系数R2为0.977 3，该模型方程可以解释样本中约97%的数据，符合要求。

3.5 葛根素在多成分环境下溶解度组合建模

在进行单元建模时发现不同的化学背景对葛根素溶解度的影响变化较大，不同的加入成分其自身处于不同化学背景时，其表现出对葛根素溶解度的影响程度也会发生变化，也就是说输出变量变化的同时，自变量效应大小会因为自变量的组合方式不同而发生改变。

基于这种情况，有必要对上述单元建模的数据进行系统汇集，进行单元组合建模，这样不仅能简化预测方程数量，同时能将上述所阐述的各种变化的信息融合到一个数据模型中，能实现更准确地用一种模型去预测多成分对葛根素溶解度的影响。以黄芩苷、甘草酸和小檗碱加入比例作为过程输入，以葛根素溶解度作为过程输出，对此过程采用3种建模方法，分别为回归模型、高斯过程、神经网络，建立相应的研究模型。并以RMSEC，RMSEP，AAEC，AAEP和决定系数R2对各模型的性能进行评价，各模型评价结果见表4。

表4 模型构建评价表

Table 4 Evaluation form of model building

No.建模方法

校正集（Calibration set）验证集（Validation set）

RMSECAAECR2RMSEPAAEPR2

1回归模型（OLS）0.772 00.619 90.928 40.836 40.727 50.859 4

2高斯过程（GPR）001.000 01.232 90.968 80.694 5

3神经网络（ANN）0.725 30.587 90.936 80.663 00.585 40.911 6

注：RMSE：均方根误差;Average Absolute error（AAE）：平均绝对误差;R2：决定系数。

由3种模型的评价结果可以发现，不同模型对于校正集样本的拟合及对于验证集样本的预测结果存在一定的差异。从校正结果可以发现，神经网络建模RMSEC（0.725 3）最低，AAEC（0.587 9）最低;而预测结果中，也是神神经网络建模的RMSEP（0.663 0）最低，AAEC（0.585 4）最低，决定系数（0.911 6）最大。因此选择神经模型作为单元组合建模的数学模型。

4 讨论与展望

4.1 葛根素溶解度研究的最佳pH制缓冲液选择

葛根素的溶解度受溶液的pH背景影响较大。pH在4.0以下时，pH对葛根素溶解度几乎没有影响，并且溶液中随着葛根素溶解度的增加溶液的pH不变。为了在后续试验中，继续观测这种溶液pH变化对葛根素溶解度的影响情况，因此pH 1.0和pH 4.0的缓冲体系不适合做为实验对象。此外，葛根素pKa1约为7.4[5]，根据Henderson-Hasselbalch方程[6]，葛根素在pH 7.4背景下，其解离型和未解离型的比例约为1∶1，在pH 6.8和pH 7.0条件下其解离型和未解离型的比例约为1∶10和1∶2.5。加入其他成分后溶液的pH主要是向弱酸性方向调节，更多的是对葛根素解离变化有影响，因此如果选择pH 6.8和pH 7.0缓冲液的话，葛根素的解离型所占比例较少，pH微弱的增加或者减少都会对整体产生较大的变化，使实验测定的误差变大。同时，考虑到后续葛根素在体肠吸收研究中，实验中所用到的K氏液pH为7.4（肠道生理背景），溶解度试验所选择的pH背景与后续试验的pH环境保持一致更为理想。综上所述，葛根素在多成分环境下的溶解度研究选择pH 7.4缓冲溶液作为pH环境溶液。

4.2 中药生物药剂学分类系统溶解性研究的数学建模方法

单一成分的溶解度研究已经提出了明确的理论基础和研究方法，并建立了多种研究模型，但是多成分体系下研究药物吸收评价方法和理论基础相对缺乏，本实验以多成分环境的影响为对象，重点考察其对溶解性的影响，探索中药生物药剂学分类系统中溶解度研究的方法。鉴于中药成分的复杂性，逐一成分实验测定溶解度的工作量巨大，同时也受到中药化学成分标准品缺少的影响，因此作者利用复方中高含量成分，设计人工构建多成分环境的方法，通过少量实验构建数学模型方程的方法开展研究，以期利用数学模型方程对多成分环境对中药成分溶解度进行预测，并结合实验阐明溶解度受多成分环境影响的变化规律。

4.3 展望

多成分多靶点的中药特点已被前辈科研工作者在不同角度的科研点上得以发现并阐述，在中药生物药剂学分类系统研究中，溶解性作为分类依据之一，应着重于多成分环境对其影响的整体结果呈现。但一直没有恰当的方法对多成分环境下的溶解度进行整体评价。因此采用递进方案，从单成分到多成分进行层次化论证，并以多成分环境作为整体开展对目标成分受多成分环境影响开展研究是可探索的发展方向。

[参考文献]

[1] Rajesh Krishna， Lawrence Yu. Biopharmaceutics applications in drug development[M]. New York： Springer，2008：26.

[2] US Department of Health and Human Services， Food and Drug Administration， Center for Drug Evaluation and Research （CDER） .Guidance for industry： waiver of in vivo bioavailability and bioequivalence studies for immediate-release solid p roducts， based on a biopharmaceutics classification system[EB/OL]. 2007-12-17. http：//www. fda. gov/cder/guidance/3618fnl. htm.

[3] Matheron G. The intrinsic random functions and their applications[J]. Adv Appl Probab，1973，5（3）：439.

[4] Whittle P. Prediction and regulation by linear least-square methods[M]. London： English Universities Press，1963：5.

[5] 刘西京，杨大坚，罗杰英，等.紫外分光光度法测定葛根素的解离常数[J]. 时珍国医国药，2006，17（11）：2206.

[6] De Levie Robert. The henderson-hasselbalch equation： its history and limitations[J]. J Chem Educ，2003，80：146.

Impacts of multicomponent environment on solubility of puerarin in

biopharmaceutics classification system of Chinese materia medica

HOU Cheng-bo1， WANG Guo-peng2， ZHANG Qiang1*， YANG Wen-ning1， LV Bei-ran1， WEI Li1， DONG Ling1*

（1.Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China;

2. Zhongcai Health （Beijing） Biological Technology Development Co.， Ltd.， Beijing 100055， China）

[Abstract] To illustrate the solubility involved in biopharmaceutics classification system of Chinese materia medica （CMMBCS）， the influences of artificial multicomponent environment on solubility were investigated in this study. Mathematical model was built to describe the variation trend of their influence on the solubility of puerarin. Carried out with progressive levels， single component environment： baicalin， berberine and glycyrrhizic acid; double-component environment： baicalin and glycyrrhizic acid， baicalin and berberine and glycyrrhizic acid and berberine; and treble-component environment： baicalin， berberin， glycyrrhizic acid were used to describe the variation tendency of their influences on the solubility of puerarin， respectively. And then， the mathematical regression equation model was established to characterize the solubility of puerarin under multicomponent environment.

[Key words] biopharmaceutics classification system of Chinese materia medica; multicomponent environment; solubility; puerarin; mathematical modeling

doi：10.4268/cjcmm20142305