SELDI-TOF-MS技术检测正常肾细胞株与肾癌细胞株的差异表达蛋白

[中图分类号]R737.11　[文献标识码]A　[文章编号]1185-1672(2007)-08-0677-04

摘要目的　分析体外培养的正常肾细胞株和肾癌细胞株的蛋白质表达差异。方法　运用表面增强激光解吸离子化蛋白质芯片(SELDI-TOF-MS)技术检测了常规体外培养的正常肾细胞株(HK-2)和肾癌细胞株(786-0)。两种细胞株均用IMAC3(固定金属亲和)和WCX2(弱阳离子交换)两种芯片检测。采用PBSIIC型蛋白质芯片阅读机读取数据，Ciphergen proteinchip3.1软件采集数据，Biomarker Wizard软件分析两种细胞株的蛋白差异。结果　SELDI-TOF-MS技术检测发现体外培养的肾癌细胞株与正常肾细胞株的蛋白质存在差异表达，共有15个蛋白质水平发生变化。IMAC3芯片发现差异峰6个，WCX2芯片发现差异峰9个。结论肾癌细胞株与正常肾细胞株之间的蛋白质谱表达有差异蛋白。

关键词　肾癌；发病机制；蛋白质组学；SELDI

肾癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤之一，其发病率占全身恶性肿瘤的3％。全世界肾癌的发病率每年增加2％，每年死于肾癌者近100000例。在我国肾癌发病率仅次于膀胱癌居泌尿系肿瘤第二位，近年来有逐年上升的趋势，是威胁人民健康的最重要肿瘤之一，同时也是成人肾脏最常见的恶性实体瘤。约50％的患者首次就诊时已属晚期，约40％的患者术后转移或复发，转移性肾癌预后较差，平均存活时间小于1年，3年存活率低于5％。但就是这样一种对人类威胁如此之大的疾病，我们对其发病机制并不是非常清楚。目前国内外对肾癌发生机制的研究大都是在基因水平，但基因的功能活动要靠蛋白质来体现。由于存在转录后剪切和翻译后的修饰加工，使得基因组DNA或mRNA的水平并不完全代表蛋白质的水平，也就是说基因的种类和数目不等于mRNA的种类和数目，mRNA的种类和数目也不等于蛋白质的种类和数目。因此，要对生物功能的执行者一蛋白质进行研究，从蛋白质整体水平来探讨肿瘤组织或细胞蛋白质结构功能关系及蛋白质间的相互作用，阐明其癌变的本质。本文应用SELDI-TOF-MS技术对体外培养的正常肾细胞株和肾癌细胞株进行了蛋白质差异分析，建立了相应的蛋白质表达图谱，发现了一系列差异蛋白，从而为在蛋白质水平上研究肾癌的发病机制及新的治疗靶位的寻找奠定了一定的基础。

1　材料和方法

1．1 试剂及芯片　HPLC水，乙氰，尿素，Tris-cL，HEPES，CHAPS,TritonX-100，SPA，三氟乙酸均购自Sigma公司；蛋白质芯片(IMAC3，WCX2)购自Ciphergen公司；PRMI1640购自GIBCO公司；胎牛血清购自杭州四季青公司。

1．2细胞来源　肾癌786-0细胞株购自上海生命科学研究所；正常肾细胞株HK-2由青岛大学分子生物实验室提供。

1．3细胞的培养

1．3．1肾癌786-0细胞株的培养　在长满肾癌786-0细胞的培养瓶中加入0.25％的胰酶消化液，37℃CO2孵箱中孵育2分钟，倒掉消化液，加入含10％胎牛血清的PBMI1640培养液反复吹打，1:2传代。置于5％CO2，37℃的培养箱中常规培养。

1．3．2正常肾HK-2细胞株的培养　在长满肾HK-2细胞的培养瓶中加入0.25％的胰酶消化液，37℃CO2孵箱中孵育4分钟，倒掉消化液，加入含15％胎牛血清的PRMI1640培养液反复吹打，1:2传代。置于5％CO2，37℃的培养箱中常规培养。

1．4细胞蛋白质的制备　细胞传代第二天，细胞生长旺盛，约占培养瓶80％。应用无菌刮刀刮取细胞，用预冷的PBS洗3遍，细胞计数。加入裂解液(8MUrea，4％CHAPS，40mM Tris-HCLPH7.4)按200μl/5.0×106个细胞加入。4℃剧烈震荡30分，14000nmp离心30分。上清采用蛋白核酸分析仪测定蛋白浓度，加入裂解液调节至所有样品浓度为2mg/ml，上清分装-86℃冰箱保存备用。分别采用IMAC3和WCX2芯片检测，每个样品至少在两个以上的同种芯片上检测。以排除同一种芯片之间的组间差异。

1．5 IMAC3蛋白芯片的实验步骤　a．将芯片装入蛋白工作平台，每孔加入5μl100mM硫酸铜，温盒内孵育15分钟，不要使芯片在空气中干燥b．重复上述操作一次。c．用流动的去离子水清洗芯片10秒以移去过多的铜。d．用大量的50Mm,PH4.0的醋酸钠．清洗芯片。e．再用流动的去离子水清洗一次。f．每孔加入5μl缓冲液(PBS中含250mM氯化钠和0.1％Triton X-100)。震荡孵育5分钟。g．将蛋白芯片放入蛋白工作平台，每孔加入200μl缓冲液。剧烈震荡，室温孵育5分钟。h．弃去缓冲液，每孔立即加入50μl：2稀释于缓冲液中的样品(蛋白终浓度1mg/m1)震荡孵育1小时。I．弃去样品，每孔加入200μl缓冲液洗涤2次，每次5分钟。j．每孔加入200μl水洗涤，立刻甩干。k．从蛋白工作平台中取出蛋白芯片，空气中干燥。1．每孔加入0.5μlSPA,重复一次。m．干燥后用蛋白质飞行质谱仪进行质谱分析。

1．6 WCX2蛋白芯片的实验步骤 a．将芯片装入蛋白工作平台，每孔加入200μl缓冲液(50Mm NaAc，PH4.0)，置于震荡器，室温孵育5分钟。b．重复上述操作一次。c．每孔中加入50μl 1:2稀释于缓冲液中的样品，剧烈震荡，孵育1小时。d．弃掉样品，每孔用200μl结合缓冲液洗涤2次，每次5分钟。e．弃去孔中液体，每孔加入200μl水洗涤，立刻甩干。f．从蛋白工作平台中取出蛋白芯片，空气中干燥。g．每孔加入0.5μlSPA，重复一次。h．干燥后用蛋白质飞行质谱仪进行质谱分析。

1．7数据采集和结果分析　蛋白质芯片采用PBSⅡC型读取数据，仪器用标准多肽校正，系统的质量偏差为0.1％。检测芯片时参数设置如下：激光强度210。检测敏感度10，优化分子质量范围为2000～10000Da，最高分子量为50000 Da，采用Cipher-gen proteinchip 3.1版本的分析软件自动采集数据，然后用Bio-marker Wizard软件分析样本细胞的蛋白质谱差异。两个蛋白峰比较时，差异蛋白定义为蛋白峰强度相差1倍以上。根据差异蛋白的分子量及等电点(WCX2芯片捕获的蛋白PI>4)，在Swiss蛋白数据库中搜索，以鉴定差异蛋白。

2　结果

2．1 WCX2蛋白芯片上肾癌细胞株和正常肾细胞株的蛋白质图谱　在相对分子量2000～30000Da的范围内，WCX2蛋白芯片

上共捕获82个蛋白峰，其中以4940和7820Da两个共有的蛋白质峰作为内参照来判断其他蛋白质的分子量。

WCX蛋白芯片上HK-2和786-0细胞株的蛋白质图谱(纵坐标为蛋白质峰强度，横坐标为蛋白质荷质比)

2．2IMAC3蛋白芯片上肾癌细胞株和正常肾细胞株的蛋白质图谱　在相对分子量2000～30000Da的范围内，IMAC3蛋白芯片上共捕获65个蛋白峰，其中以2662和7580Da两个共有的蛋白质峰作为内参照来判断其他蛋白质的分子量。

IMAC3蛋白芯片上HK-2和786-0细胞株的蛋白质图谱(纵坐标为蛋白质峰强度，横坐标为蛋白质荷质比)

a．11611.ODa在肾癌细胞株中高表达，b．5486.0Da在肾癌细胞株中高表达

WCX蛋白芯片发现的差异蛋白峰

a．5751.0Da在肾癌细胞株中高表达，b．15938.0Da在肾癌细胞株中高表达

IMAC3蛋白芯片发现的差异蛋白峰

2．3肾癌细胞株和正常肾细胞株之间稳定存在的蛋白质表达差异　在WCX2蛋白芯片上捕获的82个蛋白峰中，发现正常肾细胞株和肾癌细胞株之间的差异峰共9个，其中5486，7518，9320；11611Da在肾癌细胞株中高表达，而5056，6282，8982，11030，12782Da在肾癌细胞株中低表达。

在IMAC3蛋白芯片上捕获的65个蛋白峰中，发现正常肾细胞株和肾癌细胞株之间的差异峰共6个，其中5751，8392，15938Da在肾癌细胞株中高表达，而8102，10261，15827Da在肾癌细胞株中低表达。

2．4蛋白鉴定　将发现的差异蛋白峰在Swiss蛋白数据库中搜索()，发现WCX2芯片上11611Da蛋白峰与血清淀粉样SAA-1(serum amyloid alpha，MW11682)蛋白相符。其他的差异峰在数据库中没有发现与之相配的蛋白，可能为新的蛋白质。

3　讨论

肾癌的发生是在环境和遗传因素共同作用下，由多基因参与，经过多步骤、多阶段复杂的生物学演变过程而形成的疾病，是多基因、多阶段、多因子的动力学过程。在人类基因组计划的推动下，人们从基因水平对肾癌的发生发展进行了广泛的研究，先后发现了癌基因、抑癌基因等诸多肾癌相关基因。但是基因的功能活动最终要靠蛋白质来体现，由于翻译后的修饰、蛋白运输过程等原因常使基因表达水平和蛋白质表达的种类和数量并非一一对应，因此，即使我们了解了相关的基因，我们也没有办法全面了解肿瘤发生发展的全过程。目前研究认为肿瘤的发生发展的过程中，从组织增生产生原位癌到发生癌变，在分子水平上有不同的功能性蛋白质参与，并且功能性蛋白质很可能在各个环节相互协调共同表达，因此，目前利用蛋白质组学方法检测蛋白质谱的变化可以更加准确地了解肿瘤的发生发展机理。

SELDI-TOF-MS技术是蛋白质组学研究中的一种全新的技术平台，其弥补了传统二维电泳对低丰度、低溶解度、极端等电点值、极大(相对分子量>200000)和极小(相对分子量

肾癌细胞是由正常肾小管上皮细胞转变而来，那么肾癌细胞所表达的蛋白质必然与其起源的正常肾小管上皮细胞有所相同也有所差异。它可能含有一些正常肾小管上皮细胞所没有的某些特异蛋白质或缺少正常肾小管上皮细胞所具有的某些特异蛋白质，也可能二者具有相同的蛋白质，仅是由于在表达水平或翻译后修饰加工上存在差别。而这些差异蛋白既可作为肾癌的药物开发的靶点，又可作为肿瘤标记物用于肾癌的诊断，尤其在研究肾癌的发病机理方面有重要的价值。本研究采用体外培养的肾癌细胞株和正常肾细胞株进行蛋白质差异分析，虽然不能完全反映体内细胞的生长状态和生物学活性，但它具有成分单一，均质性好，实验条件容易控制的优点，同时可避免由于组织或血液细胞成分复杂和异质性高所引起的结果不真实和不可靠。我们的实验结果显示体外培养的细胞株具有实验重复性好，敏感性高的优点。肾脏作为人体内的代谢器官，在发生癌变的过程中，肾癌细胞所产生的蛋白质必然要分泌入血形成血清中的蛋白质，也必然要有部分通过尿液而排出。所以，目前许多研究者对肾癌患者的尿液、血液和癌组织进行了深入的研究并且发现了许多有意义的蛋白质。本实验在IMAC3蛋白芯片上发现的肾癌细胞株中高表达的5751Da差异蛋白峰与张杰等应用SELDI-TOF-MS技术对肾癌组织的研究中发现的蛋白质峰5750.4Da可能为同一蛋白，此蛋白可能为肾癌的特异性蛋白，对于研究肾癌的发病机制和肾癌的靶细胞治有重要的临床价值。此外，国内外学者还应用SELDI-TOF-MS技术对肾癌患者的血液和尿液进行了差异蛋白表达分析，得到了许多有意义的蛋白质峰，但未发现与本实验有相同的蛋白质峰，这可能是由于样本的选择所造成，具体原因仍需进一步研究。

SAA是由同基因编码的一组多形性蛋白，代表一个相对分子量为12000的家族。其主要由肝细胞产生，且广泛存在与各种脊椎动物中。SAA家族包含急性期SAA(A-SAA)和结构性

SAA(C-SAA)。而SAA-1是一种急性期反应蛋白，属于A-SAA且决定总SAA的价值。目前研究发现SAA在肺癌，卵巢癌等肿瘤患者血液中的表达有不同程度的提高。在肾癌方面，Jonathan Tolson等应用SELDI-TOF-MS技术对肾癌患者的血液进行研究发现，SAA在肾癌患者的血清中表达也增高，而且随着病情的恶化，SAA的表达水平也随之增高。因此，SAA可能与肾癌的发病有密切的关系，且其可作为肾癌病情发展的检测和药物治疗的靶向。我们发现的11611Da蛋白峰很可能是SAA-1，但这只是从分子量的角度来看，要真正的鉴定还需要对蛋白进行纯化、分离后应用串联质谱分析或肽指纹分析技术进行进一步的研究。

总之，应用SELDI-TOF-MS这一蛋白质组学技术研究肾癌细胞株和正常肾细胞株间的差异蛋白表达，为我们研究肾癌的分子标志物，药物开发的靶点以及研究肾癌的发病机理有重要的参考价值。肾癌的发生是与细胞周期及生长调控有关的蛋白相互作用的结果，对这些蛋白的深入研究将有助于我们更深入的了解肾癌的发生机制，为肾癌的预防和治疗提供有益的线索。

本实验发现的这些特异性蛋白标志物对肾癌的早期诊断有潜在的应用价值，更主要的是为研究肾细胞的癌变机理提供了一个基础，同时这些蛋白很可能成为肾癌药物治疗的新靶标。