早期肌肉特异性mRNA在骨髓干细胞的表达

作者：曾缨，张成，李才明，柳太云

【关键词】 骨髓祖代细胞；组织特异性；肌形成调节因子

Expression of early muscle specific mRNA in bone marrow stem cells

【Abstract】 AIM: To study the expression of early muscle specific mRNA in bone marrow stem cells. METHODS: The expression of early muscle specific mRNA, including MyoD, Myf5, myogenin, MRF4 and desmin, in bone marrow stem cells of C57 mice of different phases and SD rats of different generations was detected by reverse transcriptasepolymerase chain reaction (RTPCR). RESULTS: In different cultured phases (day 0,2,7) of C57 mouse bone marrow stem cells, RTPCR analysis showed the presence of Myf5 and desmin, whereas MyoD, myogenin and MRF4 were not detected. In different generations (from the primary to the 6th generation) of rat bone marrow mesenchymal stem cells, MyoD and desmin were detected, whereas myogenin and MRF4 were not detected by RTPCR analysis. CONCLUSION: Bone marrow stem cells can express early muscle specific mRNA to some extent.

【Keywords】 myeloid progenitor cells; tissuespecificity; myogenic regulatory factors

【摘要】 目的： 研究早期肌肉特异性mRNA在骨髓干细胞中的特异性表达. 方法： 利用RTPCR研究不同时期C57鼠和不同代龄SD大鼠骨髓干细胞早期肌肉特异性mRNA（包括MyoD, Myf5, myogenin, MRF4和desmin）的表达. 结果： Myf5及desmin在新鲜分离、培养了2 d和7 d的悬浮与贴壁的C57小鼠骨髓干细胞中均有表达，没有检测到MyoD, myogenin和MRF4在此时期小鼠骨髓干细胞的表达. MyoD与desmin在原代至第6代SD大鼠骨髓间质干细胞中均有表达，没有检测到myogenin和MRF4在各代细胞中的表达. 结论： 骨髓干细胞能表达一定水平的早期肌肉特异性mRNA.

【关键词】 骨髓祖代细胞；组织特异性；肌形成调节因子

0引言

在不同的诱导条件下，成体造血干细胞可分化形成脑的星形胶质细胞，少突胶质细胞，小胶质细胞，肌细胞和肝细胞等，骨髓间质干细胞在体内外也可分化为肝、软骨、脂肪、骨、肾、肌腱、脑和肌细胞等［1-2］. 目前对骨髓干细胞可塑性的研究很多，而且对骨髓干细胞表达抗原的研究普遍集中在对其表面抗原表达的研究方面，而对组织特异性抗原在未分化骨髓干细胞的表达的研究报道却较少［3］. 我们的研究旨在探讨肌肉特异性抗原desmin和成肌调节因子（myogenic regulatory factors，包括MyoD，Myf5，myogenin和MRF4）在骨髓干细胞的表达情况.

1材料和方法

1.1材料大鼠骨髓干细胞（rMSC）和小鼠骨髓干细胞(mMSC)分别取自SD鼠和C57BL/6J鼠的股骨与胫骨骨髓；正常SD鼠和C57BL/6J鼠购于中山大学中山医学院实验动物中心，体质量分别为100 g和20 g，雄性. DMEM， F10干粉培养基，胰蛋白酶粉剂，RTPCR试剂盒（ThermoscriptTMRT），Trizol（美国Gibco）；胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）(美国 Hyclone公司）；DEPC（美国Sigma公司）. 所选用或设计的RTPCR引物均至少跨越1个外显子，这就避免了因DNA污染而产生假阳性的可能性. 所有引物均由上海生工合成（表1）.

1.2方法

1.2.1rMSC的分离与原代培养乙醚麻醉SD鼠，置700 mL/L乙醇消毒1 min，超净工作台无菌条件下取出后肢股骨与胫骨，断开骨端，将骨髓细胞冲至盛有含100 mL/L FBS完全培养液的无菌小烧杯中，900 r/min离心10 min，用含100 mL/L FBS的培养液悬浮沉淀细胞，接种至培养瓶，放置50 mL/L CO2, 37℃,饱和湿度的CO2培养箱中静置原代培养.

1.2.2mMSC的分离与原代培养mMSC的培养基为含200 mL/L FBS的F10与LDMEM培养液，余同rMSC.

表1RTPCR引物（略）

1.2.3rMSC的传代待上述rMSC贴壁细胞接近80%~90%融合时，用2.5 g/L胰酶37℃消化，加入含100 mL/L FBS的培养液终止消化，收集细胞，900 r/min离心10 min，用含100 mL/L FBS的培养液悬浮沉淀细胞，将细胞悬液以1∶2或1∶3分配比例接种传代， 2~3 d换液1次，倒置相差显微镜下逐日观察、记录并照相.

1.2.4MyoD, Myf5, myogenin, MRF4和desmin的RTPCR检测提取细胞总RNA，ThermoScriptTM逆转录，PCR扩增，反应体系为：10 mmol/L dNTP 1 μL, 10×buffer 5.0 μL, 引物（10 μmol/L）上游2.0 μL，下游2.0 μL，样品cDNA 2.0 μL，Tag酶1 μL（16.67 nkat），反应总体积50 μL；反应条件为： 94℃预变性2 min94℃变性1 min59~68℃退火1 min72℃延伸1 min（30个循环）最后72℃延伸10 min4℃保存. 之后用20 g/L琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色后置凝胶自动成像仪拍照记录.

1.2.5mMSC表面标志物的检测收集培养了2 d的小鼠骨髓干细胞的悬浮部分，PBS洗涤3次，加入饱和浓度FITC荧光标记的大鼠抗小鼠CD34FITC抗体，室温下避光孵育30~45 min，PBS洗涤， FACScan流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达；再用破膜剂破膜，40 g/L多聚甲醛固定15 min，加入饱和浓度PE荧光标记的小鼠抗小鼠desmin抗体，室温下避光孵育30~45 min，PBS洗涤，FACScan流式细胞仪检测细胞质内desmin抗原的表达.

2结果

2.1C57小鼠与SD大鼠骨髓干细胞的体外培养C57小鼠骨髓干细胞的悬浮细胞（骨髓造血干细胞）和贴壁细胞（间质干细胞）均在离体培养约1 wk内迅速增殖，之后基本处于停滞状态，用一般的培养基（如DMEM, F10）培养无法对C57小鼠的骨髓间质干细胞进行传代，因为传代后细胞基本不增殖. 而SD大鼠的原代悬浮细胞在离体培养3 d内就迅速增殖，贴壁细胞潜伏期相对较长，一般10~14 d可传代，生长快的7 d就可传代，传代后细胞的生长潜伏期明显缩短，一般每3 d可传1代，生长快的1~2 d就可传代. 随着传代次数的增加，增殖速度逐渐减慢.

2.2成肌调节因子和desmin在不同时期小鼠骨髓干细胞的表达对新鲜分离（p0），培养2 d和7 d的悬浮、贴壁C57小鼠骨髓干细胞（分别以S2, A2, S7, A7表示）成肌调节因子和desmin的RTPCR检测显示：Myf5和desmin在以上各期细胞中均有表达，没有检测到MyoD, myogenin和MRF4在这些时期小鼠骨髓干细胞的表达（图1）.

M: 100 bp梯度分子量标准，最亮的条带代表500 bp；p：阳性对照；p0: 新鲜分离干细胞；S2: 培养2 d悬浮干细胞；A2： 培养2 d贴壁干细胞；S7：培养7 d悬浮干细胞；A7： 培养7 d贴壁干细胞.

图1Myf5与desmin在不同时期小鼠骨髓干细胞的表达（略）

2.3成肌调节因子和desmin在不同代龄大鼠骨髓干细胞的表达MyoD与desmin在原代至第6代SD大鼠骨髓间质干细胞中均有表达，没有检测到myogenin和MRF4在各代细胞中的表达（图2）.

M：50 bp梯度分子量标准，最亮的条带代表350 bp；p0： 新鲜分离干细胞；p1~p6： 分别为分离1, 2, 3, 4, 5和6 d干细胞.

图2MyoD与desmin在不同代龄大鼠骨髓干细胞的表达（略）

2.4骨髓干细胞表面标志物的检测利用流式细胞仪采用双染的方法发现培养2 d的C57小鼠原代悬浮细胞中存在CD34与desmin共阳性细胞（图3）.

A： 筛选细胞；B： 设置阴性对照；C： 检测CD34与desmin共阳性细胞.

图3流式细胞仪检测CD34与desmin共阳性细胞

3讨论

作为转录因子的成肌调节因子调节着脊椎动物骨骼肌的决定和分化［4］，把转录因子转移入骨髓间质干细胞的转基因与干细胞移植相结合技术已成为治疗疾病的新思路［5］.

我们的研究表明，对于新鲜分离、培养了2 d和7 d的悬浮、贴壁C57小鼠骨髓干细胞来说， Myf5和desmin在以上各期细胞中均有表达，我们没有检测到MyoD, myogenin和MRF4在这些时期小鼠骨髓干细胞的表达. 这说明骨髓干细胞的悬浮和贴壁细胞组分都能表达一定水平的早期肌肉特异性mRNA. 在肌肉发生过程中Myf5是最早表达的成肌调节因子. 我们的研究结果与Corti等［6］的研究结果近似，所不同的是后者还在以上各期细胞中检测到MyoD的表达，他们还用免疫细胞化学方法发现在新鲜分离的C57小鼠的骨髓干细胞中存在desmin与CD34共阳性的细胞，我们改进了方法，利用流式细胞仪采用双染方法证实培养了2 d的C57小鼠的悬浮骨髓干细胞中存在CD34与desmin共阳性细胞，从而验证了他们的发现. Gussoni等［7］的研究就已表明骨髓造血干细胞移植入动物体内后能转化为肌细胞. 张为西等［8］用全骨髓细胞、造血干细胞和间质干细胞移植治疗mdx鼠时， dystrophin表达率分别为 7%, 6%和 4%.

对成肌调节因子和desmin在SD大鼠不同代龄骨髓间质干细胞的表达的研究表明，MyoD与desmin在原代至第6代骨髓间质干细胞中均有表达，没有检测到myogenin与MRF4在各代细胞中的表达. 这说明大鼠骨髓间质干细胞也能表达一定水平的早期肌肉特异性mRNA. Ratajczak等［9］用RTPCR和流式细胞仪研究成肌调节因子MyoD, Myf5, myogenin以及神经干细胞标志抗原GFAP和nestin,肝干细胞标志抗原fetoprotein, CK19在新鲜分离的人和小鼠骨髓干细胞中的表达，结果表明这些因子在人、小鼠骨髓干细胞的悬浮细胞中的表达明显强于它们在贴壁细胞中的表达，而且它们主要在CD34+CXCR4+, AC133+CXCR4+组分中表达.

综上所述，我们的研究证实了未分化的骨髓干细胞能表达一定水平的早期肌肉特异性抗原，虽然这些组织特异性抗原的表达水平还不足以激活骨髓干细胞向某一组织特异性细胞分化，但可为之打下基础.

【参考文献】

［1］ Pittenger F, Mackay A, Beck S, et al. Multilineage potential ofhuman mesenchymal stem cells［J］. Science, 1999,284:143-147.

［2］ 康新勤，臧伟进，胥晓丽，等.大鼠骨髓间充质干细胞体外分化特性［J］. 第四军医大学学报, 2004,25(14):1252-1255.

［3］ Manabu I, Ikuko I, Gregory RA, et al. Effects of microgravity on myogenic factor expressions during postnatal development of rat skeletal muscle ［J］. J Appl Physiol, 2002,92(1):1936-1942.

［4］ Sabourin LA, Rudnicki MA. The molecular regulation of myogenesis ［J］. Clin Genet, 2000,57:16-25.

［5］ 栗艳，闫露，沈敏. 地塞米松诱导促进BMP2基因转染的兔MSCs的成骨转化［J］. 第四军医大学学报, 2005,26(6):528-531.

［6］ Corti S, Strazzer S, Del Bo R, et al. A subpopulation of murine bone marrow cells fully differentiates along the myogenic pathway and participates in muscle repair in the mdx dystrophic mouse ［J］. Exp Cell Res, 2002,277(1):74-85.

［7］ Gussoni E, Soneoka y, Strickland CD, et al. Dystrophin expression in the mdx mouse restored by stem cell transplantation ［J］. Nature, 1999,401(6751):390-394.

［8］ 张为西，张成，刘焯霖，等. Duchenne肌营养不良模型鼠骨髓移植后dystrophin 的表达［J］. 中华神经科杂志, 2002,35(6):358-360.

［9］ Ratajczak MZ, Kucia M, Reca R. Stem cell plasticity revisited: CXCR4positive cells expressing mRNA for early muscle, liver and neural cells ’hide out’ in the bone marrow ［J］. Leukemia, 2004,18(1):29-40.