激光消融退变性椎间盘对兔脊髓P物质表达的影响

【摘要】 目的 观察半导体激光消融退变性椎间盘突出症对兔脊髓P物质表达的影响，探讨其治疗椎间盘突出症的可能机制。方法 对56只成年新西兰大白兔采用纤维环切开法建立L4~5椎间盘退变模型，随机分为空白对照组(A)、实验组(B)两组，对B组的椎间盘髓核进行半导体激光辐射，术后2、4、8、12周经主动脉灌注固定处死动物，用免疫组化法检测相应脊髓中P物质含量的变化。结果 SP免疫阳性反应物集中分布于脊髓背角Ⅰ、Ⅱ层内，与空白对照组相比，实验组P物质早期表达减少，但差异无统计学意义(P>0．05)；后期表达明显减少，两者之间差异有统计学意义(P

【关键词】激光消融;椎间盘突出症;P物质

ffect of laser ablation on degenerative intervertebral disc on the expression of substance p in the spinal cord

GAO Xue-jun,ZHONG Jun.Wei fang People’s Hospital,Weifang 261041,China

【Abstract】 Objective To investigate the effect of laser ablation on degenerative intervertebral disc on the expression of substance P of Spinal cord in rabbits and the possible mechanism.Methods 56 rabbits were Selected and divided into 2 groups randomly:The group A(nonimplant control),group B(the exprement),we establish the rabbit model of degenerative L4-5 intervertebral disc through the way of annular laceration and irradiate the disc with a diode lase in group B.The animal were sacrificed at 2,4,8,12 weeks postoperatively through aorta by 4%paraform phosphate buffer,Immunohistochemistry stain was performed to evaluate the expression of the substance P.Results Light microscopy showed that the majority of the positive of the substance P was located in lamina Ⅰ、Ⅱ of the dorsal horn of the spinal pared with the group A,the contents of substance P decreased in group 2 weeks,but there were not any difference between group B and group A(P>0．05); the contents of substance P decreased significantly in group B at 4,8,12 weeks,there was a significant difference between Group B and group A(P

【Key words】PLDD degenerative；Intervertebral disc；Substance P

腰椎间盘突出症是骨科常见病和多发病。自经皮激光椎间盘减压术(Percutaneous laser disc decompression,PLDD)治疗腰椎间盘突出症获得成功以来，PLDD以其操作方便、损伤小、并发症少、术后恢复快等特点受到欢迎和重视，成为治疗该病的有效方法之一[1]。本实验通过纤维环切开法建立兔腰椎间盘突出模型，模拟激光射频消融髓核，研究半导体激光消融退变性椎间盘突出症对兔脊髓P物质表达的影响，探讨激光射频消融治疗椎间盘突出症的机制。

1 材料与方法

1．1 实验动物和手术方法 健康新西兰大白兔56只，体质量2．5~3．5 kg，雌雄不限，随机分为2组，每组28只。取背部右后外侧切口，长约3 cm，自背肌与后腹膜之间进入，分离暴露L4~5腰椎间盘前外侧部分，以11号尖刀片在椎间盘纤维环前外侧靠近下终板处做一长约3 mm平行上下终板的横切口，深及纤维环内层。彻底止血，A组不作任何处理，逐层缝合，B组用18 g穿刺针平行于上下终板刺入L4~5椎间盘髓核中央，引入直径400 μm光导纤维，调整激光器工作模式，设定为脉冲式发射，功率10 W，辐射持续时间0．5 s，间隔1 s，总能量300 J。进行椎间盘辐射，辐射完毕后撤除穿刺针及光导纤维，关闭创口。术后予青霉素钠20万U/kg，肌内注射5 d。

1．2 脊髓标本的固定及制备 分别于术后2、4、8、12周将每组各7只，共56只经主动脉灌注固定动物取脊髓。在灌注固定前深度麻醉动物，经左心室插管至升主动脉，先快速灌注生理盐水800 ml，再以1 500~2 000 ml含4%多聚甲醛的0．1 mol/L磷酸缓冲液(PB，pH7．4,4℃)灌注固定，时间约60 min。再经背部原切口暴露L4~5椎间盘，沿L4~5椎间盘所压神经根找到相应节段脊髓，以神经根起始处为中心切取长约1 cm的脊髓标本，经标记后放入原固定液中固定48~72 h，常规脱水、透明、石蜡包埋。

1．3 试剂 兔抗P试剂盒、DAB显色试剂盒及其他试剂均购自北京博奥森生物技术有限公司。

1．4 SP免疫组化染色(SABC法)用石蜡切片及制备连续横切片，片厚4 μm,裱贴于预先涂有0．1%多聚赖氨酸的玻片上，37℃温箱烘干备用。用SABC法进行免疫组化反应。简要过程如下:①切片常规脱蜡至水；②3%双氧水封闭20 min；③1:20正常羊血清工作液室温孵育15 min；④兔抗SP血清37℃孵育2~3 h；⑤生物素化羊抗IgG室温45 min；⑥SABC复合物室温45 min；以上各步骤之间均用0．01 mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7．4)洗5 min×3次。最后用新鲜配制的0．05%DAB-0．01%H2O2混合液显色5~7 min，镜下控制显色程度。常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。阴性对照:每次染色均设空白对照(PBS取代一抗)和替代对照(正常山羊血清取代一抗)。染色结果用Olypus BX50显微镜观察并摄片。

1．5 检测方法 每只动物随机取2张切片，用图像分析仪(Leica~Q500IW，德国)检测脊髓背角Ⅰ、Ⅱ层内SP免疫阳性纤维及其终末的光密度(OD)值。每侧背角Ⅰ、Ⅱ层内SP免疫阳性染色区域分为外侧区、内侧区、Lissauer区、背内侧区及内侧区，分别测定这五个区域的OD值，取其平均值作为该侧脊髓背角的OD值。

1．6 统计学处理 所有数据采用(x±s)表示，采用SPSS11．5统计软件，组内比较用配对t检验，组间行单因素方差分析及两两比较，P

2 结果

2．1 动物行为反应的改变 A组动物术后均出现舐、咬右下肢，肢体的颤抖、跳跃、竖毛等疼痛反应。部分动物出现右下肢无力甚至行走不稳或困难，并且随时间延长而逐渐加重；B组动物术后也出现以上行为反应，但较A组动物表现轻，并且随时间延长上述行为反应逐渐减轻甚至消失。

2．2 脊髓SP含量的变化 光学纤维镜下SP免疫阳性反应物集中分布于脊髓背角Ⅰ、Ⅱ层内，呈棕黄色颗粒状、索状或串珠状分布；背景呈淡黄色；免疫染色所进行的对照试验均呈阴性反应。术后2周时，A、B组脊髓背角Ⅰ、Ⅱ层内SP免疫阳性反应物OD值无明显差别(P>0．05)，术后4、8、12周时，A组脊髓背角Ⅰ、Ⅱ层内SP免疫阳性反应物OD值显著升高，B组脊髓背角Ⅰ、Ⅱ层内SP免疫阳性反应物OD值显著降低，A、B组在各时间点的SP免疫阳性反应物OD值有明显差别(P

3 讨论

随着临床医学水平的提高，临床上手术治疗腰椎间盘突出症传统手术和微创治疗。微创经皮激光椎间盘减压术(PLDD)在1987年由Choy和Ascher首先报道，对于椎间盘突出症的微创治疗方法，PLDD有其独特的优势，如无不良反应、穿刺简单、对正常结构损伤小及脊柱稳定性基本无破坏等等.游箭等[2]论证证实了PIDD是治疗腰椎间盘突出症的一种简便、安全、有效的微创治疗方法。

P物质是一种肽类物质，是参与感觉，特别是痛觉的一级传入神经纤维末梢的递质。与P物质有关的系统被认为是痛觉的兴奋性调控系统，其广泛存在于脊髓背角浅层和后联合核区的终末纤维中[3]。在周围神经中SP主要由背根神经节细胞合成，然后沿着背根传入纤维转运至位于背角最背部第1和第2层的末梢，以及周围神经纤维和游离神经末梢。

以往认为，腰椎间盘不含神经终末纤维，仅周围的筋膜以及与后纵韧带相连的部分有无髓鞘神经纤维。随着实验技术的提高,许多学者观察到人类正常的椎间盘纤维环外1/3有神经纤维和游离神经末梢广泛分布[4,6,7]，终板也有纤维分布[5]。在腰背疼痛患者,特别是经椎间盘造影证实的椎间盘突出患者中,神经末梢可以深入纤维环的内带、甚至髓核中[6,8]，这些纤维中部分为SP免疫反应阳性神经纤维，可以和血管伴行。有慢性腰背疼痛的患者中，神经纤维和血管往往同时有增生，SP反应阳性纤维增多，反映出SP在神经纤维的蓄积。现已认识到SP是引起慢性腰背疼痛的重要神经递质。

在PLDD应用于临床前后，许多学者对其进行了相关的基础研究，研究范围集中在PLDD治疗椎间盘突出症的机理，组织学变化及激光热损伤作用等方面。日前多数学者[9-11]认为PLDD的主要机理在于经激光消融汽化部分髓核组织后，椎间盘内压大幅度下降，甚至引起突出的推间盘组织回纳，从而减轻神经根压迫，缓解临床症状，然而椎间盘内压力的变化与临床疗效是否存在必然的联系尚存疑问。于是，许多学者对PLDD的治疗机理提出了不同的阐释。Hellinger等[12]认为激光除汽化效应外，还有收缩效应，即组织吸收激光能量后产生较高温度(60℃左右)，引起胶原纤维收缩，致使椎间盘组织缩小。较高的温度还会凝固分布于纤维环上的末梢神经和伤害感受器，减少疼痛刺激的传入。Knight[13]的长期临床疗效观察提示减压不是PLDD良好疗效的主要原因，椎间盘内激惹物质产生减少及盘内和纤维环神经再生受阻也可能起着重要的作用。在本实验中，实验组P物质早期表达较空白对照组减少，但差异无统计学意义，后期表达明显减少，二者之间差异有统计学意义。从而推测PLDD治疗椎间盘突出症的机理可能是激光射频消融减轻了突出的椎间盘对SP阳性纤维的压迫以及炎性介质对SP阳性纤维的刺激，从而减少了背根神经节细胞合成的SP的量，达到治疗效果。但对PLDD减少SP的中间环节尚待进一步研究证实。

参考文献

1 Nerubay J，Caspi I，Levinkopf M，et al.Percutaneous laser nucleolysis of the intervertebral lumbar disc．An experimental study．Clin Orthop，1997，337(1):42-44.

2 游 箭，廖顺明，丁仕义，等.经皮腰椎间盘激光减压术的早期实验与临床研究.中国介入影像与治疗学，2005，2(1):48-53.

3 Peng B,Wu W.Hou S,et al.The pathogenesis of discogenic low back pain.J Bone Joint Surg Br,2005,87(1):62-67.

4 Ashton IK,Roberts S,Jaffray DC,et al.Neuropeptides in the human intervertebra disc.J Orthop Res,1994,12(2):186-192.

5 Brown MF,Hukkanen MV,McCarthy ID,et al.Sensory and sympathetic innervation of the vertebral endplate in patients with degenerative disc disease.J Bone Joint Surg Br,1997,79(1):147-153.

6 Freemont AJ,Peacock TE,Goupille P,et al.Nerve in growth into diseased intervertebral disc in chronic back pain.Lancet,1997,350(9072):178-181.

7 Ashton IK,Walsh DA,et al.Substance P in intervertebral discs.Bindingsiteson vascularendo the lium of the humanannulus fibrosus.Acta Orthop Scand,1994,65(6):635-639.

8 Coppes MH,Marani E,Thomeer RT,et al.Innervation of painful in lumbar discs.Spine,1997,22(20):2342-2349.

9 Choy DS,Ascher PW,Saddekni S,et al.Percutaneous laser disc decompression.A new therapeutic modality.Spine,1992,17:949-56.

10 Yonezawa T,Onomura T,Kosaka R,et al.The system and procedures of percutaneous intradiscal laser nucleotomy Spine.1990,15:1175-1185.

11 Casper GD,Hartman VL,Mullins LL.Results of a clinical trial of the Hohnium:YAG laser in disc decompression utilizing a side-firing fiber:a two-year follow-up.Lasers Surg Med,1996,19:90-96.

12 Hellinger J.Technical aspects of the percutaneous cervical and lumbar laser disc decompression and nucleotomy.Neural res,1999,21(1):99-100.

13 Knight M,Goswami A.Lumbar percutaneous KTP532 wavelength disc decompression and ablation in the management of discogenic pain.J Clin Laser Med Surg,2002,20(1):9-10.