自身免疫性脑脊髓炎大鼠CD4+CD25+T细胞、CD86分子的变化及意义

[摘要] 目的：探讨实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）大鼠CD4+CD25+T细胞、CD86分子的变化及意义。方法：模型组用豚鼠脊髓和完全弗式佐剂混匀乳剂诱发大鼠EAE，观察两组的发病情况；HE染色和髓鞘染色观察病理改变；流式细胞仪检测外周血CD4+CD25+T细胞、CD86分子。结果：模型组大脑、脑干、脊髓炎性细胞浸润明显，髓鞘改变明显；模型组CD4+T细胞、CD86分子显著增多，CD4+CD25+T细胞显著减少，差异有统计学意义（P

[关键词] CD4+CD25+T细胞；实验性自身免疫性脑脊髓炎

[中图分类号]R744.51 [文献标识码]C [文章编号]1673-7210（2008）04（c）-152-02

CD4+CD25+T细胞是调节性T细胞（regulatory T cell,Treg）中的一群能对潜在具有伤害性的自身反应性T 细胞进行调控的细胞群。近年的研究表明，调节性T 细胞不仅在维持静息状态下的外周耐受中发挥作用，而且对于抑制正在进行的免疫反应、重建自身耐受至关重要。CD4+CD25+T细胞与多种自身免疫性疾病有关，重症肌无力（MG）患者胸腺切除后CD4+CD25+T数目恢复，增高的CD4+CD25+T与疾病的稳定性相关[1]。CD86是一种协同刺激分子，可与T淋巴细胞表面上的CD28或CTLA4分子相结合提供协调刺激信号，激活T细胞，形成克隆扩增，负责Th2的免疫反应，在T细胞活化时发挥重要作用[2]。本实验主要研究实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental allergic encephalomyelitis EAE）大鼠CD4+CD25+T细胞、CD86分子的变化及意义。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1实验动物及分组健康纯种远交雌性Wistar大鼠40只，8~10周龄，体重180~220 g。豚鼠15只（用于制备抗原），雌雄不限，300~400 g。随机将大鼠分为2组，分别为正常组10只，模型组30只。

1.1.2试剂20%乌拉坦、完全弗式佐剂（Sigma公司提供）、卡介苗（卫生部上海生物制片研究所）、小鼠抗大鼠CD4-FITC、小鼠抗大鼠CD25-R-PE、小鼠抗大鼠CD86-FITC、阴性对照IgG2a-FITC、IgG1-R-PE、IgG1-FITC(均由CALTAG LABORATORIES公司)。

1.1.3动物的饲养所有大鼠在免疫接种后，将其放入饲养室喂养，每笼5只，室温控制在22℃左右，保持饲养干燥、清洁。

1.2方法

1.2.1实验性自身免疫性脑脊髓炎模型制备将豚鼠断头处死，剪开枕骨及椎管剥离脊髓，去掉马尾与脊髓膜。称重，加入等量的生理盐水，用匀浆机（YQ-3,日本）制成50％的脊髓匀浆（GPSCH）。再与等量的CFA（每毫升含卡介苗5mg）混匀后制成油包水型乳剂，置于4℃冰箱备用。模型组在足底真皮下及颈部3点共注射0.5 ml GPSCH+0.5 ml CFA。正常组，在足底真皮下及颈部3点共注射0.5 ml NS+0.5 ml CFA。

1.2.2模型成功的评价标准[3]0分，未发病；1分，动物尾部无力；2分，动物尾部无力＋前肢或后肢中等无力；3分，前肢或后肢严重无力，将鼠翻到后不能复位；4分，肢体瘫痪，将鼠翻到后不能复位；5分，濒死状态。1分及以上为实验模型成功。规定致敏当日为第0天，并在每日早晚各两次观察动物行为学方面的变化，予以详细记录，同时每天测1次体重。于第21天时全部处死。

1.2.3血中CD4+CD25+T、CD86+细胞测定将模型组评分在1分及以上的大鼠依发病时间的不同，依次从心脏取血2~3 ml，放在抗凝管中，正常组在造模后21 d统一眼球取血，放在抗凝管中。将采集的血标本在6 h内进行细胞表型分析。取抗凝全血40 μl，依次加入CD4单克隆抗体、CD25单克隆抗体以及CD86单克隆抗体各5 μl，在暗箱孵育20 min，经溶血、稀释后，通过流式细胞仪（COULTER EPICS）检测，以SYSTEMⅡ获取数据和分析，分析CD4+CD25+T细胞、CD86+细胞。

1.2.4病理学检查处死模型组评分在1分及以上的大鼠，正常组在免疫以后第21天统一处死，取大脑、脑干和脊髓放在10%的甲醛中固定，然后包埋，切片，常规HE染色，砂罗硌花青法髓鞘染色，光镜下观察病理改变及脱髓鞘的情况。

1.3统计学方法

采用SPSS 13.0软件包进行统计处理，计量资料使用表示，采用t检验。P

2结果

2.1 行为学观察

模型组大鼠于免疫后13 d开始发病，表现为活动减少，进食少，精神不振，体重减轻，先出现尾肌力降低，尾巴拖地不能抬起，继而后肢无力、瘫痪。模型组发病12只，发病率为40%。

2.2病理学改变

HE染色观察到：模型组大鼠在发病急性期，大脑、脑干和脊髓内可见有大量淋巴细胞浸润，聚集在小血管周围呈袖套样改变。髓鞘染色发现：发病的大鼠脑和脊髓结构疏松，呈弥漫性脱髓鞘改变。

2.3 CD4+、CD4+CD25+T细胞测定

与正常组比较，模型组CD4+T细胞、CD86+分子显著增多，CD4+CD25+T细胞显著减少，差异有统计学意义（P

3讨论

本实验采用我国常见的非敏感系鼠Wistar大鼠来制作多发性硬化动物模型，即EAE，造模的成功率为40%，与国内报道的40%~50%基本一致，本实验依此来讨论EAE大鼠CD4+CD25+T细胞、CD86分子的变化及意义。

Hafler DA[4]提出CD4+CD25+T细胞对自身反应性T细胞的抑制能力明显减弱，此外在体外单细胞克隆实验中，MS患者的CD4+CD25+T细胞明显比正常人的少。本实验证实了模型组的大鼠血中CD4+CD25+T细胞比正常组低，与Hafler报道相符。

虽然CD4+T细胞在EAE发病机制中起重要作用，但CD4+CD25+T细胞也具有免疫调节功能，可以阻止CD4+T细胞介导的器官特异性自身免疫性疾病[5]。CD4+CD25+T细胞通过促进Th2细胞因子的分泌及降低自身反应性T细胞对神经组织的反应性来治疗MS[6]。

协同刺激分子CD86在抗原提呈细胞与免疫活性细胞间的免疫调节网络中发挥重要的作用，近年来许多学者对EAE，非肥胖性糖尿病（NOD）等自身免疫性疾病的研究中表明CD86在Th细胞的分化中也有重要意义[7]。本实验中，模型组的CD4+CD25+T细胞数明显低于正常组（P

[参考文献]

[1]Sun Y,Qiao J,Lu CZ,et al. Increase of circulating CD4+CD25+T cells in myasthemia gravis patients with stability and thymectomy[J].Clin Immunol,2004,112(3):284-289.

[2]Bugen L,Dallmon S.Co-stimulation of T cells[J]. Respir Cur Canc Med,2000,162(4):164-168.

[3]Encinas J A,Lees MB,So bel RA, et al. Identication of genetic loci associate with paralysis, inflammation and weight loss in mouse experimental autoimmune encephalomyelitis[J].Int Immunol,2001,13(3):257-264.

[4]Hafler DA.Loss of functional suppression by CD4+CD25+ Regulatory T cells in patients with multipul sclerosis[J].J Exp Med,2004,199(7):971-979.

[5]Sto A,Naka jima H,lkeda K,et al.CD4+CD25+Tcell development is regulatea by at least distinct mechanisms[J].Blood, 2002,99:555-560.

[6]Kukreja.Multiple immune regulatory defects in type-1 diabetes[J].J Clinical invest,2002,109: 131-140.

[7]朱晓勇,李大金,孙晓溪, 等.大鼠抗小鼠CD80/CD86单克隆抗体的制备与鉴定[J].上海免疫杂志,2001,21(1):55-56.

（收稿日期：2008-01-03）

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