葵鼠近视模型建构研究

近视是眼科的常见病、多发病，其发生机制还不清楚。研究者们通过使用两种经典的近视实验模型即形觉剥夺性近视和离焦性近视模型，对实验性近视做了大量的研究工作。研究显示，两种实验模型下，实验眼视网膜及脉络膜视黄酸的合成和分泌增加，并与眼球的生长呈正相关［1-3］。视黄酸可能作为重要的视觉信号转导因子参与调控眼球的生长，然而其作用机制并不清楚［4］。为进一步研究视黄酸对眼球生长的调控作用，本研究建立了外源性视黄酸近视诱导模型，现报告如下。

1材料与方法

1．1材料

1．1．1主要试剂与仪器

眼科A超仪(美国泛美公司，型号:176599，探头:100MHz)，多功能气体麻醉机(德国麦蒂AREA-CT4型)，镜片箱及检眼镜，冰冻切片机(德国MICROM，型号:HM525)，RA标准液(美国Sigma公司)。

1．1．2实验动物及分组

取3～4d龄的健康三色豚鼠共20只，随机编号，登记分组，雌雄不限，体质量100g左右，室内饲养，饲养室内采用日光灯照明，在光照时间内供给动物充足的食物和水，自然昼夜周期，室温22～24℃。实验结束时，豚鼠的生长状态基本一致。所有豚鼠分别编号并随机分为2组，正常对照组10只，视黄酸诱导组10只。正常对照组，每日上午1000时喂饲0．5mL花生油;视黄酸诱导组，每日上午1000时按24mg•kg－1喂饲0．5mL花生油调配的视黄酸。

1．2方法

1．2．1屈光度测量

喂饲前和喂饲后第5天各检查1次，由同一验光师(未知动物组别)验光。验光前先给予结膜囊内滴10g•L－1环戊通滴眼液3次，每次间隔10min，待瞳孔散大后行带状光检影，在工作距离1m处以0．5D的间隔分别进行水平和垂直子午线上的检影，散光以半量等效球镜计算。

1．2．2眼球超声检测

喂饲前和喂饲后第5天进行，用多功能麻醉机气体(体积分数1%氟烷+体积分数99%氧气)麻醉豚鼠。用眼科A超测定双眼眼轴长度(取角膜内皮面到眼球后极部玻璃体视网膜界面的距离)，以自动模式连续测量10次，使用Scope软件统计并计算平均值，精确到0．1μm。

1．2．3巩膜切片HE染色

分别选取正常对照组和视黄酸诱导组后极部巩膜进行HE染色，显微镜下观察巩膜变化，使用Imagine图像处理软件测量并计算各组后极部巩膜的厚度。

1．2．4透射电镜观察后极部巩膜

分别选取正常对照组和视黄酸诱导组后极部巩膜相同部位处进行透射电镜检查，观察巩膜组织中胶原纤维的数量、直径以及排列变化。

1．3统计学方法

各组数据结果记录为均数±标准差(珋x±s)，两组比较用t检验，采用SPSS17．0进行统计分析，取P＜0．05为差异有统计学意义。

2结果

2．1屈光状态

实验前两组豚鼠眼屈光度差异无统计学意义(P＞0．05)。实验第5天视黄酸诱导组豚鼠眼的屈光度为(+1．73±0．80)D，正常对照组豚鼠眼的屈光度为(+6．50±1．60)D，与正常对照组相比，视黄酸诱导组的豚鼠眼屈光度平均增加了－4．80D，两组比较差异具有统计学意义(P＜0.01)。

2．2眼轴长度

实验前两组豚鼠眼轴长度比较差异无统计学意义(P＞0．05)。实验第5天正常对照组的豚鼠眼的眼轴长度为(7．628±0．009)mm，视黄酸诱导组豚鼠眼的眼轴长度为(7．743±0．005)mm，两组比较差异具有统计学意义(P＜0．01)。

2．3诱导后豚鼠巩膜厚度的变化

HE染色结果显示和正常对照组比较，视黄酸诱导组眼巩膜明显变薄(图1)。测量两组眼巩膜厚度可见视黄酸诱导组的豚鼠眼巩膜厚度为(0．089±0．009)mm，正常对照组的豚鼠眼的巩膜厚度为(0．108±0．005)mm，与正常对照组相比，视黄酸诱导组的豚鼠眼巩膜明显变薄，差异有统计学意义(P＜0．01)。

2．4透射电镜结果

与正常对照组相比，视黄酸诱导组的豚鼠眼巩膜胶原纤维数量减少，具体表现为胶原直径变小，分裂明显，呈毛刷状，胶原结构稀疏，“胶原复合体”(位于巩膜成纤维细胞附近，正常对照组表现为中心致密，周边稀疏)中心区变得稀疏(图2)。

3讨论

我们知道，动物实验的优势在于简单和易控制性，它虽不能完全模拟人类疾病的全过程，但将动物实验中观察到的现象和结果加以分析，为人类近视眼的发病机制提供有用的信息，是此类实验研究的目的。本研究通过简单的喂饲方法增加外源性视黄酸的给予，增加动物眼内视黄酸的含量，观察视黄酸对巩膜的影响。我们选择用豚鼠进行实验，因其属于哺乳动物，眼部结构和基因序列与人类接近，性情温顺，易于观察和实验。以往的研究显示［5-6］，每天以24mg•kg－1的视黄酸喂饲小鸡和豚鼠，均可显著地提高视网膜及脉络膜视黄酸的含量，并在用药后2d即可检测到眼轴增长及巩膜变薄。新生豚鼠出生后即能睁眼活动，自由饮食，且较易诱导眼球生长。本实验中，我们选取3～4d的新生豚鼠，每天按24mg•kg－1喂饲视黄酸，持续用药5d，结果发现与正常对照组相比，视黄酸诱导组的豚鼠眼轴增加了115μm的轴长，差异有统计学意义(P＜0．01)。以往Howlett等［7］的研究显示，对于这个阶段的豚鼠，每增长50μm的眼轴长度将相应增加2D的近视度。本实验的屈光度结果显示，正常对照组豚鼠的屈光度为(+6．50±1．60)D，喂饲视黄酸豚鼠的屈光度为(+1．73±0．80)D，形成相对性的近视漂移，这和McFadden等［5］的实验结果基本一致。无论是人类近视眼还是实验诱导的动物近视眼模型，都会出现巩膜变薄，巩膜细胞外基质的重塑，这也是导致眼球轴长增加和屈光近视性改变的生物学基础［8-11］。在本实验研究中，我们通过喂饲方法建立外源性视黄酸诱导的近视模型，对视黄酸诱导组豚鼠和正常对照组豚鼠巩膜做HE染色，并在显微镜下观察测量其巩膜厚度发现:和正常对照组相比，视黄酸诱导组的巩膜明显变薄。在透射电镜下观察，与正常对照组巩膜相比，视黄酸诱导组巩膜胶原纤维数量减少，胶原直径变小，分裂明显，呈毛刷状，胶原结构稀疏，这与李瑾等［12］使用球旁注射视黄酸的方法诱导实验性近视的结果一致。由此证实，外源性视黄酸在诱导豚鼠眼轴增长的同时还直接作用于巩膜并参与了巩膜重塑，本模型可作为很好的动物模型为进一步探讨视黄酸引起巩膜重塑的机理提供实验依据。