急性脑梗死患者中性粒细胞活化的研究

【摘要】 目的 探讨中性粒细胞活化在急性脑梗死疾病患者中的意义。方法 抽取急性血栓形成性脑梗死患者及健康志愿者外周血，运用流式细胞技术检测中性粒细胞表面黏附分子cd 62l和cd 11b/cd 18表达。运用放射免疫分析检测血浆il?6、il?8、tnf?α水平，用酶联免疫吸附试验检测血浆il?10水平。结果 相对于正常组，脑梗死组中性粒细胞cd 11b/cd 18平均阳性表达率显著升高(p<0.001)；cd 62l平均阳性表达率明显降低；细胞因子水平均明显升高(p<0.001)。结论 在急性血栓形成性脑梗死的急性期，中性粒细胞处于活化状态。以细胞黏附为表现的中性粒细胞活化加快了血栓的进程，可能是血栓形成的重要发病原因之一。

【关键词】 急性血栓形成性脑梗死； 中性粒细胞活化； 细胞黏附； 细胞因子

significance of neutrophil activation on polymorphonuclear neutrophil in patients with acute cerebral infarction

yuan ping, zhou jing, zhou xiang?yu.

(the affiliated hospital, luzhou medical college, luzhou,646000,china)

abstract: objective to study the significance of polymorphonuclear neutrophil activation in patients with acute cerebral infarction.methods forty never treated cerebral infarction (ci) subjects have been selected to the study, thirty healthy subjects were studied as control groups. expression of cd 62l and cd 11b/cd 18 on pmn were analyzed by flow cytometry(fcm). radioimmuno assay(ria) were used to detect plasma level of il?6, il?8, and tnf?α, enzyme?linked immunosorbent assay (elisa) were used to measure plasma level of il?10.results the average positive expression percentage of cd 11b/cd 18 of neutrophil from the patients with acute ci is higher than the control group(p<0.01), and the average positive expression percentage of cd 62l is lower than the control group(p<0.01). the levels of plasma cytokines in the ci groups were increased markedly compared with normal control(p<0.001).conclusion expression of cd 11b/cd 18 and cd 62l and level of plasma cytokines might be regarded as the marker of pmn activation, pmn activation plays an important role in acute ci by expedite the progress of thrombosis, increase the inflammation around thrombus and degree of injured blood vessel.

key words: acute cerebral infarcton; polymorphonuclear neutrophil activation； adhesion molecule; cytokine

随着对血栓及炎症研究的深入，中性粒细胞（polymorphonuclear neutrophil, pmn）活化及其表面黏附分子表达异常在急性脑梗死（cerebral infarction, ci）的发生、发展中的重要作用日益受到重视[1]。为此，本实验试图通过检测外周血中性粒细胞cd 62l和cd 11b/cd 18的表达以及细胞因子水平，探讨pmn活化在此类疾病中的作用。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选择2006年3月至2006年7月在泸州医学院附属医院神经内科住院的急性脑梗死患者40例，其中男19例，女21例，年龄35~59岁，平均47.2±8.4岁。入选标准：发病72 h以内，符合第四届全国脑血管病会议制定的诊断标准的ci患者，并经ct或mri证实,排除栓塞性ci、腔隙性ci及其它病因ci；排除妊娠、感染、肿瘤、先天性抗凝因子缺陷或血管异常者。正常健康志愿者30例，男16例，女14例，年龄18~53岁，平均45.3±4.6岁。均系无心、肝、脑、肾和感染性疾病及糖尿病的健康成年人。两组年龄及性别无统计学差异（p>0.05）。

1.2 cd 11b/cd 18和cd 62l的检测

1.2.1 标本采集 病例组及正常对照组清晨空腹经肘静脉采血2 ml（1∶9肝素抗凝），轻轻混匀，6 h内行流式细胞仪测定。

1.2.2 标本准备 采用双染色法，分别取实验组及对照组血标本100 μl加入20 μl藻红蛋白（pe）标记鼠抗人cd 11b单克隆抗体（pe?cd 11b，美国beckman coulter 公司）与异硫氰酸标记（fitc）标记鼠抗人cd 62l单克隆抗体（fitc?cd 62l，美国beckman coulter 公司），避光静置，室温孵育20 min。先后加入immunoprep a液（美国beckman coulter 公司配方）650 μl破坏红细胞膜，以及immunoprep b液265 μl（美国beckman coulter 公司配方）保护白细胞膜，振荡均匀后流式细胞仪上机检测。每份样本均以大鼠抗小鼠pe?igg1及fitc?igg1（美国beckman coulter 公司）为阴性对照。

1.2.3 流式细胞仪检测 美国beckman coulter公司epics?xl型流式细胞仪，利用cellquest流式细胞图象数据分析软件，分析设定计数达到1×105次“事件”(events)后，检测中性粒细胞cd 11b/cd 18及cd 62l表达，然后用中性粒细胞对抗体的阳性表达率来表示实验结果。见图1。

1.3 细胞因子的检测

1.3.1 标本的采集与制备 于清晨空腹采静脉血3 ml，其中dvt组均为发病7 d以内，置未加抗凝剂的洁净生化管中，以离心半径8 cm, 3 000 r/min离心20 min分离血清，分别按1次用量分装，置-40℃冰箱保存备用。

1.3.2 检测方法 运用ria法检测血浆il?6、il?8、tnf?α水平，相应的放免试剂盒由中国人民总医院科技开发中心放免所提供；用elisa法检测血浆il?10水平，人il?10 elisa试剂盒由美国r&d公司提供。方法均按照试剂盒操作步骤进行。

1.4 数据统计 各组数据以均数±标准差表示。两组间比较采用t检验。相关分析采用pearson相关分析(双尾法)。所有统计学处理均由spss 11.4软件包完成。

2 结 果

2.1 两组外周血pmn表面cd 62l的表达 脑梗死组外周血cd 62l的平均抗体阳性表达率（61.058±8.925）%明显低于正常组(73.316±1.276)%,差异具有统计学意义。(p<0.001）。见表1、图2、图3。

2.2 两组外周血pmn表面cd 11b/cd 18的表达 脑梗死组外周血cd 11b/cd 18的平均抗体阳性表达率(55.598±10.356)%，显著高于正常组(20.031±0.540)%差异有显著性(p<0.001）。见表1、图2 、图3。

2.3 两组细胞因子水平比较结果 静脉血栓组il?6、il?8、il?10、tnf?α水平均显著升高，与正常对照组相比差异有统计学意义（p均<0.001）。见表2。 表1 ci组与对照组cd 62l、cd 11b/cd 18阳性表达率比较表2 2组血浆il?6、il?8、il?10、 tnf?α水平比较 两组比较p<0.001

3 讨 论

随着对ci研究的深入，越来越多的研究结果表明，炎症反应在ci中具有重要的意义，而pmn活化在炎症过程中的作用日益受到重视。haceberg等[2]通过体外研究动脉血栓模型以及临床血栓疾病，证实在狭窄动脉的血管腔内，有pmn大量地聚集，而且与血栓的进展和血小板的活化有关。而esposito等[3]研究血管手术移植物血栓发现，pmn活化，黏附分子表达水平显著变化。

在ci和炎症过程中，pmn通过细胞表面的黏附分子与血管内皮发生黏附，导致中性粒细胞在微血管中积滞，并释放溶酶体酶、组胺、白三烯等活性物质，以及il?6、il?10、tnf?等细胞因子，损伤内皮细胞及血管壁，促进血管收缩及血小板黏附、聚集，导致血栓形成。 同时，缺血性脑梗死患者黏附分子升高促使白细胞黏附于血管内皮，形成小栓子，阻塞微循环，引起组织缺血和损伤；随后，黏附于血管内皮细胞表面的白细胞与浸润于脑组织的白细胞相互激活后，产生和释放氧自由基、血管活性物质等，导致血管进一步损伤，加剧了缺血缺氧的过程。

黏附分子中的选择素（selectin）介导了最初的黏附，在滚动和牢固黏附过程中，伴随细胞因子的释放和表达，整合素（integrin）起重要的作用，引起pmn的进一步活化。在这些黏附过程中，以l?选择素（l?selectin，cd 62l）和整合素αmβ2（cd 11b/cd 18，mac?1）及其相应的配体所起的作用较大 [3,5] 。文献已证实cd 62l和cd 11b/cd 18可以作为pmn活化时的特征性标志物[6]。

在血栓形成过程中，通过 cd 11b/cd 18传递跨膜信息，可以诱导中性粒细胞产生il?6,il?8,il?10,tnf?等细胞因子；而血栓炎症局部的巨噬细胞、血液中的单核细胞和中性粒细胞合成的细胞因子等炎症介质，又可以迅速上调黏附分子的表达，导致内皮细胞、白细胞、血小板进入活化状态的作用[7]。

关于pmn活化在ci发病中的研究不多，结果也不一致，且国内还未见系统的报道黏附分子cd 62l和cd 11b/cd 18表达的情况。我们运用fcm检测pmn表面黏附分子表达，减少了体外分离pmn诱导黏附分子表达异常所造成的人工假象。结果发现在ci患者外周血中，与健康对照组相比，存在pmn表面黏附分子cd 62l表达的下调和cd 11b/cd 18表达的上调，这就说明在ci中pmn是处于活化状态的，pmn活化时l?选择素和β2整合素表达的异常以及二者之间相互影响在动脉血栓疾病中起重要的作用。

血栓形成、炎症反应都离不开细胞与细胞间信息传递与相互作用。而这种相互作用途径之一是通过可溶性介质，即细胞因子和其他化学介质。研究证实[8]，炎性细胞因子il?6、il?8、il?10、tnf?α在动脉血栓形成中发挥重要的作用。其中il?6、il?8、tnf?α起致炎症作用，而il?10起抗炎症作用，可能是重要的保护性抗炎因子。

本研究结果显示，在急性ci患者外周血中炎性细胞因子il?6、il?8、il?10、tnf?α水平是显著升高的，说明无论致炎因子还是抗炎因子，在ci疾病的发病过程中均发挥重要的作用。炎症时，炎性细胞释放细胞因子il?6、il?8、tnf?α等炎症介质，促进炎性细胞与血管内皮间的黏附，加快了炎症的进程，以及血栓周围炎症程度和血管壁的损伤。而同时释放的抗炎因子il?10等则通过降低黏附分子的表达，抑制白细胞的外渗而发挥抗炎作用。

通过对动脉血栓的研究发现[6]，当用il?6、tnf?α干预后， cd 11b/cd 18抗原表达明显升高，同时il?6 降低细胞黏附分子l?选择素（cd 62l）的水平，其机制可能通过直接降低pmn上cd 62l的转录与翻译起作用。也有研究[7]认为tnf?α与白细胞作用可以引起cd 11b/cd 18表达的增加和cd 62l的脱落，其生物学效应可能经 nf?κb通过受体介导途径来实现。 狄政莉[9]等研究鼠缺血再灌注模型发现 il?8再脑缺血再灌注时水平急剧上升，表明il?8可能对中性粒细胞与内皮细胞的黏附及进入损伤区起趋化作用。frenkel等[10]研究证实， il?10 通过抑制th1细胞，从而阻止th1型炎症反应，减轻脑卒中引起的损伤。

本实验证实，在ci的急性期， pmn活化可能起重要的作用。细胞黏附分子介导了pmn、血管内皮细胞、血小板之间相互聚集与黏附，这一过程贯穿了血栓形成的发生、发展过程。观察细胞黏附分子cd 62l和cd 11b/cd 18表达以及炎症细胞因子水平，对临床ci疾病早期监测、判断病程和判断预后有重要意义。本实验也为进一步开展抗pmn活化治疗提供了理论依据。

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