土壤DNA提取研究进展

摘要：DNA提取是分子生物学研究的基础，提取的DNA具备足够的纯度和结构完整性是进行PCR扩增等分子分析所必需的条件。土壤的组成和结构复杂，且类型多样，影响土壤DNA提取的因素有很多，研究土壤微生物多样性，关键是提取出足够数量、纯度、适当片段长度、具有代表性的土壤DNA。本文对土壤DNA提取的相关方面作了些论述，并探讨了DNA提取对土壤微生物多样性评估的偏差影响，最后进行了讨论和展望。

关键词： DNA提取 土壤 微生物多样性

土壤是微生物生活的主要场所，蕴含着丰富的微生物资源并表现出高度的多样性，据估计每克土壤中含有4000-7000种近109个细菌细胞，含有几千到上百万种不同的基因组信息。长期以来，对土壤微生物的研究仅限于极少部分可培养的微生物，而这种可培养的微生物还不到自然界微生物总量的1%，实际上绝大多数环境微生物都是不可或很难被培养的，利用传统的培养方法研究土壤微生物多样性，具有很强的偏好性。随着发展起来的宏基因组学利用分子生物学的研究方法绕过培养方法来研究微生物多样性及功能这一局限，为土壤微生物研究开辟了新的道路[1]。而宏基因组学技术在研究土壤微生物方面的关键第一步是提取DNA。

提取高浓度、大片段、多样性程度高、具有代表性的土壤微生物总DNA对土壤微生物多样性研究至关重要。然而，土壤是一个非常复杂的异质体系，其中含有的腐植酸及腐植酸类似物、酚类化合物、重金属离子等，在DNA提取过程中如不能有效去除，将直接影响后续的PCR扩增、核酸杂交、内切酶消化等分子操作[2]。土壤微生物DNA的提取纯化是一个耗时、繁琐的过程，许多学者一直在探索更加快速、高效、低成本的土壤DNA提取方法。下面就近年来已发表的国内外DNA提取相关方面的文献，对DNA提取作了些论述。

一、土壤DNA

土壤中的DNA主要存在于细胞核内，核内DNA占整个细胞DNA量的90%以上，核外DNA主要有线粒体DNA和质粒DNA，因此，土壤DNA提取主要获得的是核内DNA[3]。

二、影响土壤DNA提取的主要因素

影响土壤DNA提取的因素主要有以下几点：1）DNA与土壤环境基质的相互作用。DNA与粘土矿物、高含量有机质等之间的吸附会降低DNA提取产量。2）DNA共提取物。土壤中含有的腐植酸及腐植酸类似物、酚类化合物、重金属离子等对土壤DNA提取存在影响，限制性内切酶活性在共提取的腐植酸浓度为0.8-51.71μg/mL时就受到抑制，且Taq聚合酶对腐植酸具有高抑制敏感性[4]。3）DNA的降解、损失或损伤。土壤样品保存方法不当，会导致微生物细胞降解或DNA降解，如土壤样品储存在4℃下3周，高分子量DNA显著减少[5]；还有DNA提取过程越繁琐或步骤越多，DNA损失就越多，DNA提取过程中的剪切力也会对DNA分子会造成损伤。4）细胞不完全裂解。

三、土壤DNA提取方法

土壤样品的DNA提取，通常包括细胞裂解、细胞碎片的去除和核酸的沉淀与纯化三个步骤。根据微生物细胞是否需要从他们的环境基质中分离出来，可将DNA提取方法分为直接法和间接法，直接法耗时短且具有更好的DNA恢复率，可以获得更好体现样品微生物多样性的代表性DNA，从而直接法得到更为普遍的应用[6]。

已经出现了很多被接纳并广泛使用的土壤DNA提取方法，可以说这些方法被当作了标准。其中，Zhou 等[7]于1996年提出了一种多元组成土壤DNA恢复方法，该研究为应对某一具体的土样提供了指导便于选择适当的DNA提取和纯化方法。有人在此基础上，改进了方案，来提取几种性质不同的土壤样品DNA，并得到了较好的结果[8]。而有些土壤样品来自于极端环境或由于本身特性，提取出满足用于分子分析的DNA比较困难。这时结合使用不同的细胞裂解方法就显得特别重要（常见的细胞裂解方法见表1）。例如引进土壤预洗涤程序用于提取一般有机质（腐植酸）和金属离子含量比较高的森林土样DNA，DNA提取产量和质量可以得到改善[9]。风沙土壤本身微生物数量较低，需要采取特殊的土壤处理方法，以获得足够产量的DNA，张颖等人也报道了一种风沙土壤微生物总DNA提取方法，获得的DNA可直接用于PCR分析[10]。还有，一些极端环境如火山土壤样品DNA提取面临着粘土和其他矿物含量高的难题，Ruth M.Henneberger等[11]尝试了各种提取方法，最终成功地提取到了效果较好的DNA，这都证明了结合使用不同提取处理的重要性。

DNA提取技术除了在土壤样品上的应用外，还有很多其他的环境样品如沉积物、堆肥、植物组织、动物标本、消化物或粪便、骨骼牙齿、化石冰与冻土、碳酸盐岩石、唾液等。另一方面，DNA提取技术的不断发展与成熟也促进了市场上出现了许多各种各样的商业化DNA提取试剂盒。S.M. Dineen等[12]比较了6种商业DNA提取试剂盒用于三种土样细菌孢子的DNA提取，结果表明FastDNA？SPIN kit提取DNA产率最高，而E.Z.N.A.？Soil DNA和PowerSoil？DNA Isolation kits在去除壤土提取物中PCR抑制物方面表现出最高的效率。

以上所诉的大多属于直接法，直接法虽然产量高，但是纯度一般较低，有时需要进一步的纯化，获得的DN段也较小；相对而言，间接法虽然需要另外的特殊处理材料和足够的土壤数量，耗时长，但获得的DNA纯度高、长片段多，且含有更少的真核基因序列，在进行深入的微生物群落测序和克隆构建福斯质粒文库方面，间接法是一个有用的方法[13]。

四、土壤DNA提取方法对土壤微生物多样性分析的偏差影响

已报道的从土壤中提取DNA的方法有很多种，但大多数只适用于有限的土壤类型，这些核酸提取方法也会有复杂的低效性，不可避免地会引进各自的偏差[14]。Jan Dirk van Elsas等[15]比较分析了四种提取方法获得的DNA多样性，发现方法对表观丰度和群落结构有明显的影响，其中，通过两种方法获取土壤DNA得到了一种迄今未描述的放线菌组。为了改善宏基因组方法，研究DNA提取偏差以及提供一些工具便于评价不同组的丰度，Tom O.Delmont等[16]人也设计并开展了实验，他们的工作强调了提取的DNA库与目前无法获取的完整土壤宏基因组之间的不同。

目前，绝大多数土壤微生物基因组总DNA提取时采用的是一次裂解，而一次裂解并不能得到较为完全的土壤宏基因组，因此一般基于提取的DNA分析获得的土壤微生物多样性可称为表观土壤微生物多样性。为了尽量获取完整的土壤样品DNA，Larry M.Feinstein等[17]在评估了一个常用土壤DNA提取试剂盒时，改变了细胞裂解方案，对粘土、砂土和有机质土壤子样品进行多次连续DNA提取，得出大部分DNA能够通过前几次提取获得，并且通过集中三次连续提取，DNA提取的偏差可以得到很大程度降低。同样，郭等的实验结果也证实了这点，土壤DNA的3次连续提取最低回收率占5次连续提取的76%以上，而且与新鲜土壤相比，风干过程显著降低了土壤微生物丰度，但利用风干土壤中微生物丰度的变化趋势反映新鲜土壤中微生物数量变化规律具有一定的可行性，这也为使用风干土壤进行土壤微生物多样性研究提供了一定的依据[18]。

五、讨论与展望

对于同一份土壤样品，不同的DNA提取方法获得的DNA往往具有差异而表现出方法特异性。DNA提取也会有复杂的低效性，土壤宏基因组DNA的不完全提取，土壤中的腐植酸、蛋白质等物质对PCR的抑制，这些都会对土壤微生物多样性造成偏低的评估，提取的土壤DNA质量将直接影响到后续的分子生物学分析的真实性。目前，没有一种DNA提取方法适用于所有类型的土壤样品，在面对一些棘手的土壤样品DNA提取时，可采取一些不同的提取方法。

土壤DNA提取是进行土壤分子生物学分析的关键步骤，也是一个限制步骤。随着PCR芯片和高通量测序技术的不断发展和应用，对大批量土壤样品DNA的快速获取也变得迫切需求。虽然市场上出现的商业DNA提取试剂盒已为土壤DNA的获取提供了不少方便，但在应对较多的土壤样品量，还是需要消耗较多时间来手工操作，缺乏自动高效性。 因此，必须寻求更加高效的DNA提取方法。■

参考文献

[1] 钮旭光，韩梅，韩晓日. 微生物学通报，2007， 34（3）：576-579.

[2] 宋培勇，马莉莉. 安徽农业科学，2010，38（24）：12978-12980.

[3] 郑璐，高乃云. 科技信息综述，2010，36（5）：175-178.

[4] C C Tebbe and W Vahjen. Appl. Environ. Microbiol， 1993， 59（8）：2657.

[5] C.C. Tien， C.C. Chao， and W.L. Chao， Jounal of Applied Microbiology， 1999，86：937-943.

[6] C.L. Roose-Amsaleg， E. Garnier-Sillam， M. Harry. Applied Soil Ecology， 2001， 18：4760.

[7] Jizhong Zhou， Mary Ann Bruns， and James M. Tiedje. Appliedand Environmental Microbiology， 1996， 62（2）：316322.

[8] 张海燕，王彩虹，龚明福，等. 生物技术通报，2009，（8）：151-155.

[9] Jizheng He， Zhihong Xu， Jane Hughes. Soil Biology & Biochemistry， 2005， 37：23372341.

[10] 张颖， 曹成. 东北大学学报，2010，31（11）：1640-1643.

[11] S.M. Dineen， R. Aranda IV， D.L. Anders， and J.M. Robertson. Journal of Applied Microbiology， 2010， 109：1886-1896.

[12] Tom O. Delmont et al. Journal of Microbiological Methods， 2011， 86：397-400.

[13] ？zgül Inceoglu et al. Appl. Environ. Microbiol， 2010， 76（10）：3378.

[14] Tom O. Delmont et al. Appl. Environ. Microbiol， 2011， 77（4）：1315.

[15] Larry M. Feinstein， Woo Jun Sul and Christopher B. Blackwood. Appl. Environ. Microbiol， 2009，75（16）：5428.

[16] 郭，吴宇澄，林先贵，等. 微生物学报，2012， 52（7）：894-901.

作者简介：韩朋（1988-），男，汉，湖北襄阳，硕士，学生，研究方向：地址工程。