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关键词：HSP27；HSP47；HSP70；肾脏纤维化
【中图分类号】Q51;R692 【文献标识码】A 【文章编号】1672-3783(2012)06-0237-01
1 HSP27与肾脏纤维化
HSP27是小分子热休克蛋白家族主要成员，在细胞抗应激损伤、维持细胞内环境的稳定方面发挥着重要作用，参与多种效应反应[3]。
有研究报道，热应激、ATP耗竭等损伤可诱导肾小管上皮细胞表达HSP27，高渗透压可诱导肾组织细胞表达HSP27，IL-1、转化生子因子β等可诱导细胞合成HSP27，说明HSP27在肾小管上皮细胞生理和功能状态的维持和调节中发挥作用[4]。
周生国等[5]通过建立单侧输尿管梗阻肾小管间质纤维化大鼠模型，应用组织病理学和免疫组织化学法检测HSP27在肾小管间质纤维化大鼠肾组织中的表达，发现肾小管间质纤维化过程中肾皮质肾小管中HSP27的表达明显上调，主要分布于扩张的肾小管，这提示HSP27表达上调可能与肾小管上皮细胞对损伤的早期应激反应有关。
2 HSP47与肾脏纤维化
HSP47存在于内质网，与多种类型胶原和前胶原特异性结合的内质网驻留蛋白，在体内主要作为“分子伴侣”帮助新合成前胶原形成正确的三股螺旋结构，稳固前胶原的三股螺旋分子，防止结构错误的前胶原泌出内质网，协助前胶原在正常状况下分泌等，对胶原成熟的质量控制起着重要作用，与肾脏纤维化形成有着紧密的联系[6]。
正常生理情况下，肾内HSP47仅微量表达。在肾脏病理状态下，HSP47的表达或活性增加，可分布在多种细胞中如肾小球脏层上皮细胞、肾小球壁层上皮细胞等，并可直接刺激系膜细胞及肾小管上皮细胞分泌Ⅰ型、Ⅲ型及Ⅳ型胶原，积极参与肾小管上皮细胞-间质转换（EMT）过程，促进细胞外基质(ECM)的合成及过度聚集，引起肾纤维化过程中组织的过度修复，最终导致肾小球硬化和肾间质纤维化。因此，HSP47可能是肾脏纤维化的关键因子，通过HSP47为切入点研究肾纤维化，研制针对HSP47的拮抗剂，可能会找到防治肾脏纤维化的新方法。
已有研究报道，采用干扰HSP47表达的方法来改善肾纤维化[7]。在抗Thy-1肾小球肾炎大鼠模型中，HSP47反义寡聚脱氧核苷酸转染大鼠肾小球细胞，抑制了HSP47表达，从而成功减少了胶原的合成，减轻了肾小球硬化的程度。单侧输尿管梗阻大鼠模型，通过输尿管注射HSP47siRNA入梗阻侧肾，肾纤维化程度明显减轻，胶原蛋白明显减少[8]。HSP47的相关研究已经成为近年防治器官纤维化的研究热点。
3 HSP70与肾脏纤维化
HSP70是热休克蛋白家族中具有最高敏感性和高度保守性的一个家族，主要作为“分子伴侣”可促进新生多肽链的正确折叠，对解聚蛋白及维持恰当构型，分子重排以及新生多肽链在细胞内外跨膜转运有重要辅助作用。HSP70在正常细胞中含量较低，在应激状态下，蛋白合成量显著增加。
在离体的人肾培养细胞NRK52E中，暴露TGF-β诱导肾上皮细胞纤维化和细胞凋亡，通过保留上皮细胞钙粘蛋白表达水平和α-肌动蛋白来选择性诱导HSP72的表达可以抑制TGF-β诱导的肾上皮细胞纤维化，说明HSP72对肾脏纤维化有着密切的关系。该研究首次证实，HSP72通过调控Sat3介导的信号通路抑制肾间质成纤维细胞的活化、增殖以及细胞外基质的积聚，从而抑制肾脏纤维化。提示HSP72具有多途径、多水平和多靶点阻抑肾脏纤维化进程的作用，为慢性肾脏病的防治提供新的思路和途径。
由于HSP70能够加强自身体内细胞本身抗损伤潜能，有效减轻肾缺血再灌注损伤及肾间质纤维化，若能阐明HSP70基因表达调控的机制，通过无毒性的药物或基因转染等手段，诱导HSP70局部合理表达，可使肾脏细胞耐受潜在损伤刺激的能力增加，将为创伤、外科手术或移植等病理生理过程中肾脏的保护提供一个新的有效途径。
4 结语
肾脏纤维化是所有肾脏疾病发展到终末期衰竭的共同变化，及早阻止甚至逆转肾脏纤维化对防治终末期肾衰竭有重大意义。肾纤维化过程涉及很多细胞和分子参与，各种因素相互作用，机制非常复杂，本文简要介绍了HSP27、HSP47、HSP70与肾脏纤维化的关系，在肾脏纤维化过程中发挥着重要的作用，为治疗肾脏纤维化提供新的靶点和思路。但对其作用的机制和原理缺乏充分的认识，随着研究的不断深入，HSP27、HSP47、HSP70在肾脏纤维化过程中的作用机制将逐步被阐明，对防治肾脏纤维化的发生发展具有一定的指导意义。
参考文献
[1] 宋伟等.热休克蛋白70与心血管疾病关系的研究进展[J].中国心脏起搏与心电生理杂志,2011,25(2）:167-169
[2] 钟文英等.热休克蛋白的分子生物学研究进展[J].医学综述,2005,11(2):148
[3] Oh DJ et al. Heat shock protein express in adenosinie triphosphate depleted renal epithelial cells[J]. Korean J Intern Med, 2004, 19, (3):149-54
[4] 周生国等. 小分子热休克蛋白在大鼠肾间质纤维化中的表达[J].中外医疗, 2009, 27: 28-29
[5] 肖红波等. 热休克蛋白47在肾脏纤维化中的作用及机制[J].中国中西医结合肾病杂志, 2009, 10(12): 1109-1111
【关键词】 透明质酸;层粘蛋白;Ⅲ型前胶原;肾小球硬化;肾间质纤维化
Explore the relationship of Sserum fibrosis markers and renal pathology XU Hai,shan, CHEN Kai,yi, LIN Dan,hua, et al. Department of Nephrology，The Affiliated Hospital of Putian College, Fujiang 351100, China
【Abstract】 Objective To explore the relationship of the serum fibrosis markers and renal pathology. Methods 43 patients of chronic kidney disease who were made renal biopsy were detect their serum HA, LN, PC Ⅲ，then analyzed the relationship of the serum fibrosis markers and glomerular sclerosis, the serum fibrosis markers and renal interstitial fibrosis. Results No one was level 4 of glomerulosclerosis and renal interstitial fibrosis. The level of serum HA, LN, PC Ⅲ had no statistical significance in level 1 (33 cases ) and level 2 (5 cases)patients with glomerulosclerosis. Compared with level 1 and level 2 , the level of serum HA, LN, PC Ⅲ were higher in level 3 (5 cases) patients with glomerulosclerosis. The level of serum HA, LN, PC Ⅲ had no statistical significance in level 1 (31 cases ) and level 2 (7 cases)patients with renal interstitial fibrosis. Compared with level 1 and level 2 , the level of serum HA, LN, PC Ⅲ were higher in level 3 (5 cases) patients with renal interstitial fibrosis.Conclusion Elevated the level of serum HA, LN, PC Ⅲ may indicate more serious glomerular sclerosis or interstitial fibrosis.
【Key words】 Hyaluronic acid; Laminin; procollagen Ⅲ; Glomerulosclerosis ;Renal interstitial fibrosis
肾小球硬化和肾间质纤维化是慢性肾脏病进展共同病理过程，进一步可发展至慢性肾功能衰竭甚至尿毒症。如何早期发现肾小球硬化和肾间质纤维化并予以治疗,从而逆转、阻断或者延缓肾病进展,是保护肾脏功能的最重要一环。长期以来, 肾小球硬化和肾间质纤维化诊断离不开肾穿刺活检,这种损伤性检查具有明显缺陷。近10 多年来,国内外一直在寻找非损伤性诊断方法,特别是血清学诊断指标。我们以43慢性肾脏病患者为研究对象,在肾穿刺病理检查的同时,检测其外周血清纤维化指标包括透明质酸(HA)、层粘蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)水平,探索这3项指标与肾小球硬化和肾间质纤维化是否存在相关性,初步评价这些指标在肾脏病理改变中非创伤性诊断中的价值。
1 资料与方法
1.1 病例选择 选择2008年6月至2011年4月在我院住院期间行肾穿刺活检的慢性肾脏病患者。且排除了慢性病毒性肝炎、酒精性肝炎硬化和脂肪肝、乙肝病毒携带者。其中，慢性肾炎综征28例，肾病综合征15例；7例血肌酐异常，36例血肌酐正常(血肌酐正常参考值男44~133 μmol/L，女44~106 μmol/L)。
1.2 肾活检术和肾脏组织病理学检查 患者取俯卧位。腹部垫以硬枕, 在B 超引导下，采用, 5°角度斜穿, 使穿刺针与皮肤呈30°角度外斜, 以取得较多的肾皮质；逐层局麻后用20 号套管针(双峰外磨式) 连同针芯沿B 超穿刺探头槽逐层推进至肾脂肪囊, 取出针芯, 套入装有16号穿刺针(单峰内磨式) 的自动同步负压活检装置,使穿刺针前缘与套管针前缘相吻合, 并用套管针拉钩将自动同步负压装置拉在套管针上；嘱患者在深吸气末屏气，按压负压器按钮,穿刺针急速刺入肾脏,同步形成负压。1 s内将负压活检装置连同穿刺针、套管针一并拔出,穿刺结束，肾活检标本立即放入标本盒，通过邮寄送至福州总医院病理科。
1.3 血清纤维化指标检测 透明质酸(HA)、层粘蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)采用放射免疫测定 (RIA),上海海军医学研究所提供。患者肾穿刺前一天抽血，离心后留取血清，,70℃冰箱保存。择期同一个检验师同一台仪器检测操作严格按试剂盒说明书进行。
1.4 肾小球硬化程度评判标准参考Raiji 等方法［1］ 每例随机观察不重叠的10个高倍视野(10×40)，肾小球硬化个数和总肾小球比例。0级：无肾小球硬化；1级:肾小球硬化≤25 %；2 级:25 %
1.5 肾间质纤维化程度评判标准 1级,肾间质纤维化面积≤25 %；2级,25 %
1.6 统计学方法 采用SPSS 11.5软件包对数据进行统计学意义，采用t检验比较，P
2 结果
2.1 肾穿病理诊断为IgA肾病21例，狼疮性肾炎3例，系膜增生性肾小球肾炎11例，膜性肾病4例，膜增生性肾小球肾炎2例，局灶节段性肾小球硬化1例，硬化性肾小球肾炎1例。1级肾小球硬化和肾间质纤维化占绝大部分，4级肾小球硬化和4级肾间质纤维化均无1例。
2.2 肾小球硬化与血清纤维化指标关系 如表1所示，1级和2级肾小球硬化的患者血清HA、LN、PCⅢ水平差异无统计学意义。3级肾小球硬化的血清HA、LN、PCⅢ水平较1级和2级患者均升高。
2.3 肾间质纤维化与血清纤维化指标关系 如表2所示，1级和2级肾间质纤维化的患者血清HA、LN、PCⅢ水平差异无统计学意义。3级肾间质纤维化的血清HA、LN、PCⅢ水平较1级和2级患者均升高。
3 讨论
如何尽早地发现和治疗肾小球硬化和肾间质纤维化,是逆转、阻断或延缓肾病进展以保护肾脏功能的最重要一环。长期以来,只有通过肾穿刺活检才可以发现肾小球硬化和肾间质纤维化,但是目前国内还有许多基层医院还不能开展肾活检术，且活检具有有一定的创伤和风险，部分患者不易接受。因此，临床有必要寻找与肾脏病理有密切相关性的无创检查指标，以期对未做肾穿的患者的肾脏病理改变有个初步判断。
目前认为，细胞外基质分子的异常蓄积是导致器官纤维化或硬化的分子基础，血清透明质酸(HA)、层粘蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)等是细胞外基质的主要组成部分。现有多个研究发现血清HA、LN、PCⅢ与肝纤维化或肝硬化密切相关［1,4］。高春芳等［3］报道HA、Col Ⅳ与炎症及纤维化改变程度有较好相关性。P ⅢNP 水平在一定程度上反映炎症轻度、重度的变化,但在纤维化不同期差异无显著意义。林英辉［4］研究认为血清HA、LN 、PCⅢ水平检测可用于判断慢性乙型肝炎患者肝纤维化程度及评价预后。
近年也有研究发现慢性肾功能衰竭患者血清HA、PCⅢ、LN水平明显升高，尿毒症者组高于氮质血症者组，作者推断慢性肾衰患者血清HA、PCⅢ、LN水平可能与肾小球硬化、肾间质纤维化有关［5］。目前国内尚未见有关血清HA、LN、PCⅢ水平与肾小球硬化和肾间质纤维化程度的相关性的研究报告。
我们研究发现虽然1级和2级肾小球硬化程度/肾间质纤维化患者血清纤维化指标HA、LN、PCⅢ水平无明显差异，但是3级肾小球硬化程度/肾间质纤维化的上述血清纤维化指标明显高于1级和2级肾小球硬化程度/肾间质纤维化。我们推测，可能原因是肾脏慢性病变较为严重时才可能产生较多细胞外基质分子，且同时肾脏清除能力下降有关，导致血清HA、LN、PCⅢ水平升高。本研究表明血清HA、LN、PCⅢ水平与肾小球硬化肾间质纤维化程度存在一定的相关性，有望对未行肾穿刺活检的患者检测血清纤维化指标对肾脏病理有个大体推断；但由于本组研究中由于我们在肾穿刺活检病例选择上谨慎原因造成2级或3级肾小球硬化程度或肾间质纤维化患者例数较少且4级肾小球硬化和肾间质纤维化无1例，存在一些缺点，有待今后扩大研究进一步证实。
参 考 文 献
［1］ Raij L, Azar S, Keane W. Mesangial immune injury, hypertension and progressive glomerular damage in Dahl rats. Kidney Int,1984,26(2) :137,143.
［2］ Hu YY, Liu P, Liu C. et al. The value of serum markers in evaluating liver fibrotic changes. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi， 2006, 14 (3) : 174,177.
［3］ 高春芳，叶伟民，徐玲玲，等. 血清标志物在慢性肝病肝硬化诊断中的应用研究.中华检验学杂志，2001，24(2)：91,93.
［4］ 林英辉.血清透明质酸、层粘连蛋白、Ⅲ型期前胶原含量与慢性乙型肝炎病理变化的相关性研究.南方医科大学学报，2007，27(11)：1795,1796.
关键词：细胞因子；肾脏纤维化；Smad家族；HGF
细胞外基质异常增多和过度沉积是慢性肾脏病的必然结果，这将导致肾脏纤维化[1]。在肾脏纤维化的发生发展过程中存在多种细胞通路，众多的促纤维化因子参与了肾脏纤维化的发生发展过程，其中TGF-β 介导的肾小管 上皮细胞转分化（ EMT）起着核心作用[2]，而内源性的抗纤维化因子在对抗TGF-β/Smad信号所介导的纤维化过程中已日渐受到重视。
1 Smad家族与肾脏纤维化
目前已知有十多种致纤维化因子，如各种细胞因子、激素和血流动力学因素等，参与肾脏纤维化过程。但TGF-β及其下游Smad信号在肾脏纤维化中起核心作用。无论是在动物模型和人类中，TGF-β上调几乎存在于所有CKD中。在体外，TGF-β作为唯一因素可以刺激肾小球系膜细胞，间质成纤维细胞和肾小管上皮细胞激活成转化，而产生细胞外基质。相反，通过各种方法抑制TGF-β 所致的肾脏纤维化，可防止肾功能逐渐丧失。TGF-β 的信号转导也是一个会聚通路，直接或间接地影响其他纤维化因子。通过各种机制，这些smad蛋白拮抗剂有效抑制smad蛋白介导的基因转录，从而安全保护组织不受那些无谓的TGF-β反应的影响。最近研究表明，SnoN和Ski确实逐步减少肾脏纤维化，提示smad蛋白拮抗剂缺失是放大TGF-β信号的重要机制。此时，TGF-β/smad信号以没有约束、失控的方式进行传导，这可能与肿瘤发生过程中抑癌基因的作用缺失相似。最近有研究提示TGF-β1过度表达转基因小鼠主要通过TGF-β抗炎活性抑制了肾脏纤维化病变过程。TGF-β的致纤维化和抗炎作用使得单纯抑制TGF-β的治疗应用陷入了两难境地。为了解决此类问题，人开发了作用于TGF-β的下游效应器为靶点的替代方法。抑制结缔组织生长因子或抑制smad7信号传递来抑制smad信号通路可为其中选择[3]。
2基质降解酶与肾脏纤维化
在正常组织中基质的产生和降解处于动态平衡中。人们通常认为肾脏纤维化与基质的生产过剩与降解缺陷有关。肾组织产生许多蛋白酶，其中纤维蛋白溶酶原/纤维蛋白溶酶和基质金属蛋白酶（MMP）系统构成蛋白水解网络。它们可以降解基质蛋白的所有组分，从而减轻肾脏纤维化。但是，最近研究表明组织型纤溶酶原激活物（tpA）的 消融剂在梗阻性肾病中却抑制肾间质纤维化发展。tpA在梗阻性肾病中的致病作用主要取决于其诱导的MMP-9基因表达能力。MNP-9破坏肾小管基底膜的完整性，从而导致肾小管EMT的发展。纤维蛋白酶，丝氨酸蛋白酶可以直接降解基质蛋白和激活基质金属蛋白酶，这可能减轻肾脏纤维化。然而纤维蛋白酶原 基因敲除却不加重梗阻性肾脏纤维化，提示此酶有致病作用。最近一项研究还提示MNP-3诱导Rab 1的表达，这将导致细胞活性氧增加加并促进EMT[4]。
3肝细胞生长因子（HGF）与肾脏纤维化
HGF是肾脏和其它器官中存在的内源性抗纤维化因子，在器官受到各种损伤后，有显著的促进组织修复和再生。在许多方面肝细胞生长因子和TGF-β对肾脏细胞作用是完全相反的[5]。HGF通常有间质来源的细胞产生，如肾小球系膜细胞、内皮细胞、间质成纤维细胞和巨噬细胞等。HGF与受体结合引起酪氨酸激酶活化，激活细胞内多个信号的级联反应。因此，HGF是一种多效性生长因子。炎性介质（白介素-1，TNF-2，TGF- β）、去甲肾上腺素等可诱导HGF的自身及受体表达的提高，并通分内分泌、自分泌、旁分泌等方式发挥作用。在体外，HGF可有效地抑制TGF-β介导的肌纤维母细胞活化从而抑制肾小球系膜及间质纤维化，并阻止肾小管上皮细胞转分化。现已证明HGF阻断了间质中成纤维细胞Smad 2/3核转移，上调smad蛋白转录辅助阻遏物TGIF转录，诱导SNON蛋白在肾小管上皮细胞表达，从而抑制肾脏纤维化。实验证明在各种慢性肾脏病如梗阻肾、残肾、糖尿病肾病动物模型中，外源性肝细胞生长因子或其基因注射可改善肾脏纤维化、保护肾功能[6]。
总上所述，肾脏纤维化过程极其复杂。与健康的伤口愈合相比，肾小管上皮细胞转分化是发生在肾脏纤维化中的独特事件，这可能造成肾损伤并愈合失败。而这与致纤维化/抑制纤维化细胞因子失衡有关。这就提示我们在疾病的多个阶段调整两者间达到动态平衡可能对抑制肾脏纤维化有事半功倍的效果。
参考文献：
[1]You Hualiu. Renal fibrosis： New insights into the pathogenesis and therapeutics[J].Kidney international，2006，69：213-217.
[2]Rosemarie M. The role of EMT in renal fibrosis[J].Cell and Tissue Research Jan，2012，volume，347：103-116.
[3]Wang W，HuangXR，et al. Signaling mechanism of TGF-β in prevention of renal inflammation：role of samd7[J].J Am soc nephrol，2005，16：1371-1383.
[4]Edgtton KL，Gow RW，et al.Plasmin is not protective in experimental renal interstitial fibrosis[J]. Kidney int，2004，66：68-76.
[5]Yang J，Liu Y，et al.A novel mechanism by which HGF blocks EMT[J].J Am Soc Nephrol 2005，16：68-78.
基金项目：国家自然科学基金资助项目(编号：20060785)
近年来，研究了许多抑制ECM积聚的细胞因子，其中肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor，HGF)作为一种抗纤维化的因子得到了越来越多的研究。它不但能加速急性肾衰中肾小管上皮细胞的再生,而且能减缓慢性肾衰的进程。在体实验发现,加入HGF可以改善肾纤维化的程度,而加入HGF的特异性抗体则加速肾纤维化的进展，显示出良好的治疗前景。多项研究表明,急性肾衰竭(acuterenalfailure，ARF)患者血清HGF的水平呈显著增加,并在一定程度上有助于ARF患者肾功能恢复［1-3］。本文就近年来对HGF和其受体c-met的研究，以及其在肾脏纤维化动物模型中的研究作一综述。
1．HGF/c-met的一般生物学特性
1.1HGF的起源肝细胞生长因子(HGF)又名Scatter因子(scatterfactor，SF)，因其与血液凝固级连反应的酶具有结构同源性,而成为纤溶酶原相关生长因子(theplasminogenrelatedgrowthfactorsfamily，PRGFs)家族的成员之一。它最初是从部分肝切除的大鼠血浆中分离纯化获得的，因能刺激原代培养的肝细胞生长而得名。1987年日本的中村敏一从3000只大鼠的血小板中将HGF纯化成单一的蛋白质，1989年根据HGFN末端氨基酸序列成功地克隆了HGF的cDNA并得出了其全氨基酸序列，并用基因重组的方法人工合成了HGF。
1.2HGF/c-met的结构和作用机理HGF是由由分子量69kD的重链(α链,465个氨基酸)和34kD的轻链(β链,234个氨基酸)以二硫键连接而成的异二聚体糖蛋白。重链N末端的31个氨基酸为信号序列，其后由1个发夹域和4个卷曲域组成花瓣式构造，轻链含有丝氨酸蛋白酶样结构。HGF的单链前体无生物活性，双链的成熟HGF才是其具有生物活性的分子。HGF的受体是c-met原癌基因编码的一种跨膜酪氨酸激酶［4］，是目前已知的HGF的唯一受体，在肾脏表达相当广泛，主要分布于近曲小管、髓袢厚段、薄段以及集合管。c-met是由分子量50kD的α链和145kD的β链组成的异二聚体跨膜蛋白，α链在膜外，β链横跨细胞膜。β链的胞外端富含与HGF结合有关的丙氨酸，而胞内端则富含酪氨酸激酶构域。其中c末端的MDS可与信号传递分子发生特异性结合。HGF与受体结合后使酪氨酸激酶活化，导致c末端酪氨酸残基磷酸化，从而发挥HGF的多种生物学功能。HGF/c-Met信号传导途径对于胚胎发育过程中肾的器官发生，正常结构的维持和患病肾的修复和再生都起着重要作用。
HGF通常由间质来源的细胞产生，如肾小球系膜细胞、内皮细胞、间质成纤维细胞和巨噬细胞等。在肾小球区主要由内皮细胞及系膜细胞产生，在肾小管间质区主要由间质细胞和巨噬细胞产生。HGF与受体结合引起酪氨酸激酶活化，激活细胞内多个信号级联反应,包括三磷酸肌醇激酶(PI-3K)，Grb/sos/Ras复合物，Gab-1，Shp-2，磷脂酶C，Ras-GTP酶活性蛋白和c-Scr等。因此HGF是一种多效性的生长因子，对多种细胞具有多种生物学活性，包括细胞生存，增殖，移动，和分化等（5，6，7，8）。炎症介质(IL-1，INF-α，TNF-α，TGF-α等)、去甲肾上腺素均可诱导HGF的表达，值得一提的是HGF可以诱导自身及受体表达的提高。而TGF-β，糖皮质激素，1，25二羟基维生素D3和维甲酸等则抑制其表达［9］。HGF通过内分泌、自分泌及旁分泌方式发挥作用［7-10］。
2HGF与各种动物模型肾纤维化的关系
在慢性损伤后，大多数CKD动物模型中内源性HGF的表达被短暂地诱导［11-12］。两组研究群体独立地证明/论证了用中和性的抗体阻断/封闭HGF信号显著地促进了组织纤维化和肾功能异常的出现和进展［11-13］，暗示了在慢性肾脏病中诱导HGF的表达对于保护正常肾脏结构和功能是有益的。研究发现，HGF不仅阻止了慢性肾脏病（chronickidneydisease，CKD）的发生和发展也显示了它在组织已经受损时的治疗有效性。同时还发现HGF能协同其它治疗物质如肾素-血管紧张素系统抑制剂来抑制肾间质纤维化。
2.1HGF与慢性肾小球肾炎在一种ICR品系衍生的肾小球肾炎的基因小鼠（ICRstrain-derivedglomerulonephritismice，ICGNmice）的早期阶段，应用中和性的抗HGF抗体，中和内源性HGF加速了ECM的积聚，增加了转化生长因子－β1(transforminggrowthfactor-β1，TGF-β1)的表达，和肾小管的细胞凋亡，导致了进行性肾纤维化和肾功能不全［13］。
相反，给ICGN小鼠提供外源性HGF蛋白抑制了TGF-β1的表达并阻止了肾纤维化和慢性肾功能不全［13-14］。Mori等［15］用anti-Thy-1.1抗体制备的实验性系膜增生性肾小球肾炎大鼠模型进行研究，于模型制备完成的第2至第9天连续给予腹腔内注射重组的人HGF0.8mg/(kg·d)，此后连续观察8周，发现HGF干预组的大鼠肾脏肾小球的恢复加快，表现为毛细血管内皮细胞增生和毛细血管的再生。
2.2HGF与残余肾Liu和Rajur等［11］应用5/6肾切除的大鼠残余肾模型，在给予了中和性的HGF抗体后，拥有残余肾的大鼠经历了肾小球滤过率的迅速下降和血浆肌酐水平的上升，伴随肾纤维化损伤的加重，从而证明了内源性的HGF保护了残余肾进行性发展的肾纤维化和慢性肾功能不全。Dworkin等在5/6肾切除大鼠模型中加入HGF蛋白或它的基因也可以抑制残余肾的肾纤维化损伤并减轻肾功能不全。
2.3HGF与梗阻性肾病一些实验证实了给予外源性HGF减弱了通过单侧输尿管接扎造成的小鼠和大鼠梗阻性肾病模型的肾间质纤维化。Gao等制备了单侧输尿管梗阻（unilateralureteralobstruction，UUO）的大鼠模型，将外源性HGF基因导入大鼠骨骼肌细胞后，病肾的内源性HGF和c-met上调。在术后第14天与第28天，基因治疗后病肾的纤维形成，巨噬细胞浸润和小管萎缩的现象明显弱于对照组。Mizuno等分别给予UUO小鼠HGF的中和性抗体和外源性的重组人HGF，发现前者加速了病肾小管间质纤维化的进程并伴有TGF-β表达的增高，而后者则作用完全相反。Yang和Liu证实了在UUO小鼠模型中，术后3天，梗阻侧的肾脏呈现出典型间质纤维化损伤，以肌成纤维细胞活化，纤维粘连蛋白过渡表达，间质基质沉积和TGF-β1上调为表现。从这一时间点开始，连续11天给予小鼠外源性HGF，发现治疗组α-平滑肌肌动蛋白（α-smoothmuscleactin，α-SMA）水平较对照组减少大于70%，ECM和TGF-β1以及其I型受体显著的减少，抑制了肾间质纤维化的进展。
一种联合应用HGF基因和肾素-血管紧张素系统抑制剂的治疗方法已经证实能产生协同效应而减弱肾小管间质纤维化。此项联合治疗法应用了人HGF基因和一种血管紧张素II的I型受体抑制剂氯沙坦，保护了UUO大鼠梗阻侧肾脏的总体形态和结构，几乎完全消除了α-SMA，抑制了ECM的积聚和肾脏的TGF-β1及其I型受体的表达，减轻了肾间质纤维化。
2.4HGF与糖尿病肾病一些实验已经证实了外源性HGF可以显著改善小鼠和大鼠的糖尿病肾病。Dai等在链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）诱导的单肾切除后的糖尿病小鼠体内注入外源性的HGF基因，发现治疗组小鼠肾脏TGF-β1的表达被抑制，纤维粘连蛋白和I型胶原沉积减少，间质肌成纤维细胞活性被抑制，改善了糖尿病肾病的肾脏病理改变。Mizuno和Nakamura［12］应用STZ制备的糖尿病小鼠进行研究，在小鼠出现高血糖症后的第4至第6周给予抗HGF的IgG抗体，发现肾小球的病变显著的加重了。而在STZ诱导后的第6至第10周期间给予重组的HGF后，发现尽管高血糖的水平没有改变，但肾小球系膜细胞内TGF-β1的含量减少了，进行性发展的肾小球肥大和硬化也几乎完全被抑制了。Kagawa等应用一种遗传性糖尿病小鼠模型-db/db小鼠进行研究，在实验小鼠出生后12周龄时，在它们后肢肌肉处注射腺病毒编码的人HGF基因，到达24周龄时进行糖尿病肾病的评估。结果发现基因治疗组小鼠肾小球和肾小管的纤维化明显少于对照组，肾小球内皮细胞和小管上皮细胞的凋亡也显著降低，并且肾脏的TGF-β1的表达也显著减少，db/db小鼠的生存期也明显延长。Cruzado等在STZ诱导的糖尿病大鼠的早期和进展期糖尿病肾病阶段分别应用人HGF基因治疗，发现进展期糖尿病肾病大鼠的肾脏TGF-β1和系膜结缔组织生长因子（connectivetissuegrowthfactor，CTGF）的上调被抑制，同时也抑制了肾脏的金属蛋白酶组织抑制剂-I（tissueinhibitoeofmetalloproteinase-I，TIMP-1）的表达，减少了肾脏间质肌成纤维细胞的数量，减轻了肾纤维化。
2.5HGF在其它肾病模型中的作用Azuma等发现每天注射外源性HGF4周能够阻止大鼠慢性同种异体移植物肾病的进展。
Kuroiwa等在（C57BL/6×DBA/2）F1（BDF1）小鼠体内注射DBA/2小鼠的脾细胞后诱导了小鼠慢性移植物抗宿主病，并出现系统性红斑狼疮的组织病理学改变。在造模后12周内，每两周重复转染HGF基因一次，发现通过HGF基因转染有效的减少了治疗组小鼠狼疮肾炎的蛋白尿量和组织病理学改变。
另外，HGF与碘麝香草酚酸肾病和环孢霉素A肾病的动物模型中的有效性也已经被报道［15］。
3结论
研究表明，HGF作为一种内源性因子，它可以减轻慢性损伤后肾脏组织的纤维化损伤。它的抗纤维化效应主要是通过它抵抗TGF-β1的促纤维化活性来介导的。由于TGF-β1已经被广泛的认同是在各种类型的损伤后肾纤维化的发病原因，越来越多的实验证据显示，HGF是主要的抗纤维化因子可以对抗TGF-β1的活性。根据本文，我们可以发现给与外源性HGF或诱导内源性HGF的表达很可能提供一种有效的方法来治疗慢性肾脏纤维化。但是离临床应用还有一定的距离，比如给药的途径，剂量，频率等，尽管目前有较多的动物试验的证据支持，但尚需要大量的临床的试验来进一步证明。
【参考文献】
［1］SchieppatiA,RemuzziG.Chronicrenaldiseaseasapublichealthproblem:Epidemiology,social,andeconomicimplication［J］.KidneyInt,2005,68(Suppl1):S7-S10
［2］LiuKD.Molecularmechanismsofrecoveryfromacuterenalfailure［J］.CritCareMed,2003,31(8Suppl):572-581
［3］SugimuraK,GotoT,TsuchidaK,etal.Productionandactivationofhepatocytegrowthfactorinacuterenalfailure［J］.RenFail,2001,23(3-4):597-603
［4］RosarioM,BirchmeierW.Howtomaketubes:signalingbytheMetreceptortyrosinekinase［J］.TrendsCellBiol,2003,13:328-335
［5］LiuY.Hepatocytegrowthfactorandthekidney［J］.CurrOpinNephrolHypertens,2002,11(1):23-30
［6］MichalopoulosGK,DeFrancesMC.Liverregeneration［J］.Science,1997,276:60-66
［7］MatsumotoK,NakamuraT.Hepatocytegrowthfactor:renotropicroleandpotentialtherapeuticsforrenaldiseases［J］.KidneyInt,2001,59(6):2023-2038
［8］TenDijkeP,GoumansMJ,ItohF,ItohS.RegulationofcellproliferationbySmadproteins［J］.JCellPhysiol,2002,191(1):1-16
［9］GohdaE.Functionandregulationofproductionofhepatocytegrowthfactor［J］.NipponYakurigakuZasshi,2002,119(5):287-294
［10］LiuY.Hepatocytegrowthfactorinkidneyfibrosis:therapeuticpotentialandmechanismsofaction［J］.AmJPhysiolRenalPhysiol,2004,287(1):F7-F16
［11］LiuY,RajurK,TolbertE,etal.Endogenoushepatocytegrowthfactoramelioratechronicrenalinjurybyactivatingmatrixdegradationpathways［J］.KidneyInt,2000,58(5):2028-2043
［12］MizunoS,NakamuraT.SuppressionsofchronicglomerularinjuriesandTGF-β1productionbyHGFinattenuationofmurinediabeticnephropathy［J］.AmJPhysiolRenalPhysiol,2004,286(1):F134-F143
［13］MizunoS,MatsumotoK,KurosawaT,etal.Reciprocalbalanceofhepatocytegrowthfactorandtransforminggrowthfactor-β1inrenalfibrosisinmice［J］.KidneyInt,2000,57(3):937-948
［14］MizunoS,KurosawaT,MatsumotoK,etal.Hepatocytegrowthfactorpreventsrenalfibrosisanddysfunctioninamousemodelofchronicrenaldisease［J］.JClinInvest,1998,101(9):1827-1834
各种原因引起的慢性肾脏疾病进展为终末期肾衰（endstagerenalfailure，ESRF）的实质是肾脏纤维化和硬化，从而导致有效肾单位丧失和肾功能的进行性下降。近年研究揭示，炎症细胞浸润，肾脏固有细胞在致纤维化性生长因子（growthfactors，GF）、细胞因子等作用下发生表型改变等是肾脏纤维化形成的重要机制。此外，细胞外基质成分（ECM）的产生与降解过程的失调而致其过度积聚，进一步促进了肾脏的硬化和肾功能的丧失。现就肾脏纤维化形成过程中所涉及的主要机制及与此有关的治疗学进展作一简述。
1 肾小球硬化（glomerulosclerosis，GS）
无论肾病原发病因如何，终末期肾脏均表现为GS，并进而导致肾小球滤过功能的丧失。近年来GS机制研究取得不少进展，主要表现在以下几个方面。
1．1 肾小球毛细血管内皮细胞损害是GS的重要始动因素
正常情况下内皮细胞不仅是维持毛细血管结构完整的屏障，而且还可以通过自分泌或（和）旁分泌方式产生一系列的体液因子（如内皮素、NO、PGI2等）而调节局部血流动力学及凝血过程。此外，这些局部体液因子尚可通过对系膜细胞（mesangialcell，MC）的作用而调节肾小球的滤过功能。内皮细胞受损后，其抗凝活性下降，促进血小板的粘附与聚集，毛细血管微血栓形成。内皮细胞表型的改变包括细胞表面表达细胞粘附分子（celladhesionmolecule，CAM），后者促进白细胞粘附于肾小球毛细血管并继而向血管襻浸润。损伤或（和）激活的内皮细胞通过释放细胞因子如IL－1（白介素－1）、TNFα（肿瘤坏死因子α）、化学趋化因子（chemokine，如IL－8）、单核细胞趋化肽－1（MCP－1）、巨噬细胞炎症蛋白－2（MIP－2），进一步吸引炎症细胞至肾小球并导致它们的激活。IL－1，TNFα还可促进血栓的形成。因此，肾小球内皮细胞通过与循环白细胞及血小板的相互作用而启动肾小球硬化的过程。
1．2 mC在肾小球硬化中的作用
MC是肾小球内平滑肌样细胞，它可以合成和释放致炎性细胞因子和趋化细胞因子（MCP－1，RANTES）以及致纤维化性GF，如血小板生长因子（PDGF）。MC对损伤的反应是增生、发生表型改变并产生ECM。激活的血小板、核细胞及损伤的内皮细胞均可通过释放一系列因子而介导这种反应。MC增生往往是系膜硬化及GS的前奏。在所有细胞因子中，PDGF及TGFβ（转移生长因子β）已被公认在系膜增生及硬化中起最为重要的作用。大鼠体内直接注射PDGF可刺激肾脏MC增生。将人PDGF基因转移给大鼠亦导致MC增生。与PDGF不同的是，TGFβ对MC的增生具有双相性调节作用，即低浓度时起促进作用，而高浓度时起抑制作用。TGFβ还能强力促进系膜及上皮细胞合成ECM成分。最近人们发现TGFβ尚可引起MC表型改变，使其成为成肌纤维细胞（myofibro-blast，MFB）。MC的这种表型改变是其激活及增生的象征，并在临床及动物实验中证实具有较好的判断预后价值。研究证实当MC表达MFB标记性蛋白－α平滑肌肌动蛋白（α?smoothmuscleactin，α－SMA）增加时，GS程度加重，这是由于转型的MC能够合成Ⅰ、Ⅲ型胶原，而由肾小球MC释放的基质金属蛋白酶（MMPS）仅能降解Ⅳ型胶原，并不能降解Ⅰ、Ⅲ型胶原所致。有趣的是，肾小球基质成分的改变反过来又可能影响MC，进一步促进其增生和转化。
2 肾小管、间质纤维化
小管间质纤维化（tubulo－interstitialfibrosis，TIF）是肾脏硬化的一个重要特征。无论肾脏原发病变在肾小球、肾小管还是血管，大多数进展性肾病均可见到TIF，而TIF的出现又往往预示着肾脏病变预后不好。动物实验发现，如果没有同时伴有小管、间质炎症性浸润及纤维化，肾小球硬化乃至肾功能不全就很少发生。
TIF的发生机制与前述GS的机制有许多相似之处。不过肾小管细胞在其中起了十分重要的作用。因为当其受损时，它可以表达细胞粘附分子，释放趋化因子、细胞因子及GF，还有MCP－1，Osteopontin，粒－单核细胞集落刺激因子，这些因子可以把炎症细胞、单核细胞及淋巴细胞等吸引到肾间质。而单核细胞通过进一步地释放致纤维化性细胞因子，刺激成纤维细胞增生、胶原合成，从而促进TIF的形成。淋巴细胞产生IL－2（白介素－2），γ－干扰素等可通过刺激巨噬细胞产生TGFβ等进一步刺激间质的成纤维细胞产生胶原。不仅如此，肾小管细胞本身亦可通过释放IL－1，PDGF，TGFβ等而直接刺激肾间质成纤维细胞的激活与增生。此外，肾小管细胞与肾脏成纤维细胞的相互作用似乎尚受肾小管周围ECM成分的影响。例如当将小管细胞与IV型胶原共同培养时，近端小管细胞刺激肾皮质成纤维细胞的增生，而与laminin一起培养时则抑制成纤维细胞的增生。间质成纤维细胞激活后亦主要表现为获得了平滑肌细胞的某些特征而成为MFB，它表达某些结构蛋白如α－SMA，Vimentin及成纤维细胞特异性蛋白－1等。MFB通过合成ECM而促进TIF的形成。临床及动物实验均已发现，间质MFB数量的多少与TIF程度有密切关系，小管、间质细胞表达α－SMA增加，往往提示疾病预后不良，容易进展为ESRF。进一步的研究还证实，肾脏本身固有的细胞如间质成纤维细胞、血管周围细胞以及小管细胞等均可经过表型改变而成为MFB。最近有人发现这些细胞经肾小球入口或破损的包曼囊而向硬化的肾小球迁移，提示间质MFB可能参与GS的形成。
间质MFB合成和降解ECM失调亦是导致TIF的重要因素。Lemis等最近报道，当肾小管细胞与异常的ECM成分一起进行培养时，可抑制成纤维细胞释放胶原酶。此外TIF时亦发现肾小管MMPS减少，而这些酶的组织抑制因子（TIMPS）及血浆原激活因子的抑制成分（PAI）增加。总之，所有这些变化均有利于间质ECM成分的积聚，从而最终导致TIF。
3 肾内血管纤维化和硬化
肾内血管纤维化和硬化亦是终末期肾脏病理学上的一个显著特征。它与ESRF的发生有着密切的关系。近年来人们已逐渐地注意到肾内微小血管性损害对肾脏纤维化的影响。事实上无论慢性肾病是否伴有全身性高血压，肾活检标本中常可见到微小血管的硬化，而且研究发现，这种病理改变的程度直接影响着肾病的预后。肾内小血管硬化的机制可能为：⑴全身性高血压一方面引起的入球小动脉扩张，肾小球毛细血管内压（PGC）增高，肾小球肥大；另一方面引起出球小动脉扩张，继而引起管周毛细血管内压增高，内皮细胞受损。⑵毛细血管内压力的改变可刺激血小板生长因子（PDGF）、血管紧张素Ⅱ、内皮素等释放，后者进一步刺激管壁平滑肌细胞、间质成纤维细胞增生，导致管腔缩窄。小血管硬化造成局部缺血、缺氧，小管细胞萎缩。晚近有人注意到血管周围细胞（pericyte）异化成MFB，后者可分泌产生ECM，并可能移行至肾小球内，从而促进肾小球及小管、间质的纤维化。
4 治疗学进展
去除促使肾脏硬化的危险因素如高血压、高血糖、高血脂等已被证明可延缓慢性肾衰进展。另外，低蛋白、低磷饮食亦已公认是能够有效地延缓慢性肾衰进展的内科疗法之一。
近年来，在动物实验中人们发现抑制单核细胞的浸润、抑制血小板聚集及抗血栓形成等方法可有效地抑制或减轻肾脏的纤维化。此外，应用抑制CAM、趋化因子以及生长因子的方法治疗大鼠实验性肾炎模型亦已取得疗效，例如应用PDGF和TGFβ中和性抗体以及天然TGFβ1拮抗剂decorin可以预防肾小球硬化。最近有人报道内皮素受体拮抗剂可明显减轻实验动物的肾小球硬化，且与对血压的影响无关。另外，近年来大量动物实验及临床研究证明，转换酶抑制剂－血管紧张素受体拮抗剂类药物除了具有显著的降压作用外，其独特的肾脏血流动力学影响、对肾小球滤过膜通透性的作用、对脂代谢的调节作用以及减少蛋白尿、抑制生长因子分泌的作用等已使其成为目前临床上最有希望的能够延缓慢性肾衰进展的药物。
[关键词] 肾脏纤维化；活血化瘀；抗纤灵；何立群
[中图分类号] R259 [文献标识码] A [文章编号] 1674—4721（2012）09（b）—0115—02
何立群教授是上海中医药大学附属曙光医院肾内科主任、上海中医药研究院肾病研究所所长、博士研究生导师，躬身临床近30年，总结出治疗慢性肾病一系列行之有效的方法和方药，尤其擅长活血化瘀法治疗慢性肾衰肾纤维化。笔者跟随何教授临证以来，深切体会到中医药在治疗肾脏纤维化方面的特色和优势，现将何教授研制抗纤灵系列方治疗肾脏纤维化经验介绍如下：
从现代医学的角度看，肾脏纤维化（包括肾小球硬化和肾间质纤维化）是各种慢性肾脏疾病的主要病理学改变，也是各种肾脏疾病进展到终末期肾衰竭的共同通路[1—2]。终末期肾衰竭患者临床主要表现有面色黧黑晦暗，水肿，肌肤甲错，腰部、两胁固定疼痛或刺痛，足趾关节肿痛，舌暗红、青紫、瘀点、瘀斑，舌下络脉粗张及瘀紫，脉沉、细、涩、弦等。中医学根据终末期肾衰竭患者的临床表现，认为肾脏纤维化病因病机是本虚标实，脾肾亏虚为本，瘀血、湿浊、湿热、毒邪、风邪为标，就瘀血而言，可因虚致瘀、因实致瘀。根据以上理论，何师对慢性肾功能衰竭患者做了大样本的临床观察，发现血瘀贯穿慢性肾脏病的各个阶段，血瘀证在慢性肾脏病中所占比例约为67. 5%[3]。因此，何师提出早、中期慢性肾功能衰竭即使没有血瘀证的典型表现，也要给予活血化瘀抗纤维化的治疗。
1 抗纤灵方的研制和应用
在多年临床实践的基础上，何师创制抗纤灵颗粒方，该方由活血化瘀的丹参、制大黄、当归、牛膝、桃仁组成，方中丹参益气补血活血，性微寒；桃仁祛瘀活血，性平；牛膝补肾活血，性平；制大黄清热泻浊活血，性寒；全当归活血补血，性温。综观全方，以活血为特征，兼以扶正泻浊，攻补兼施，温凉并用，使泻而不伤正，补而不滞邪。现代药理研究表明，丹参能促进胶原降解，桃仁有改善肾脏纤维化，促进肾内的胶原分解，减少肾内的胶原含量，抑制肉芽形成的作用，大黄中提取的有效成分大黄蒽酮葡萄糖甙有抑制系膜细胞DNA和蛋白质合成的作用。
动物实验研究结果显示，抗纤灵方可通过降低模型大鼠血脂和24 h尿蛋白定量延缓肾小球硬化进展[4]。抗纤灵方亦通过上调结构型一氧化氮合酶诱导的一氧化氮含量，下调诱导型一氧化氮合酶诱导的一氧化氮含量，引起TGF—β1表达下调，减轻肾间质纤维化，延缓肾小球硬化，从而对肾脏起到一定的保护作用[5]。抗纤灵方能显著降低组织内TGF—β1、Smad2、Smad3、NF—κB、TNF—α、PDGFmRNA、IL—6mRNA、ATⅡ、AT1RmRNA水平，有效诱导CTGF基因表达下调，抑制性调节TGF—β1/Smads信号通路，调节TGF—β1/P38MAPK信号转导通路，减轻ECM的沉积，抑制肾纤维化的发生[6—11]。临床研究表明，抗纤灵方能延缓慢性肾功能衰竭的进展，尤其对于早中期有血瘀兼证的CRF患者疗效显著[12]。抗纤灵方可明显改善肾衰患者的肾功能、蛋白尿，临床总有效率为80%，并有降低血管紧张素Ⅰ和Ⅱ、层粘连蛋白、Ⅲ型胶原Ⅳ型胶原、TNF—α和升高纤维连结蛋白（FN）的作用[13—14]。
2 抗纤灵二号方的研制和应用
何师认为慢性肾脏疾病迁延日久，脏腑虚衰，最终将导致脾肾阳气虚衰，瘀血浊毒内阻而发诸证，故提出脾肾阳（气）虚兼血瘀证是存在肾小管间质损伤的慢性肾脏疾病患者的代表证型，在抗纤灵方的基础上创制了益气温阳、活血化瘀的抗纤灵二号方。抗纤灵二号方的组成为抗纤灵方减去当归加黄芪、仙灵脾，该方以黄芪、仙灵脾为君药，黄芪性微温，功能补气升阳、利水消肿、固表生津；仙灵脾性温，温肾壮阳、强健腰膝；二者相合，补肾健脾、益气温阳以求其本；再以丹参、桃仁、怀牛膝三药为臣，丹参善于活血祛瘀、凉血散结，有“一味丹参，功同四物”之说，为活血化瘀要药，桃仁功能破血行瘀、润燥滑肠，善泄血分之壅滞，牛膝性善下行，有活血通经之能，又善补益肝肾、利尿通淋，三药相济，共谋活血祛瘀、消积通络以求其标。制大黄力猛善行，有斩关夺将之力，功效攻破积滞、活血祛瘀、凉血止血、泻热解毒、通泄祛浊，为中医治疗关格证的要药，为本方佐药。抗纤灵二号方共达益气温阳、活血化瘀之意，以活血为主，兼以扶正泻浊，攻补兼施，寒温并用，使泻而不伤正，补而不滞邪。
动物实验研究结果显示，抗纤灵二号方通过改善肾小球、肾小管功能，减少胶原纤维积聚，下调α— SMA、TGF—β1、FN及PAI—1表达，诱导HGF的高表达，抑制ECM沉积，促进ECM降解，抑制肾小管EMT，达到改善肾间质纤维化的作用[15—16]。笔者观察了52例肾小管间质损伤患者，发现抗纤灵二号方能显著改善肾小管间质损伤患者的脾肾阳（气）虚兼血瘀证候，能减少患者尿α1—MG、尿β2—MG、24 hUPro的排泄，该方配合常规治疗能取得76.92%的总有效率。
3 典型病例
【关键词】 血管紧张素转换酶抑制药；肾素
【Abstract】 AIM: To observe the effect of angiotensinconverting enzyme inhibitor (benazepril) on intrarenal reninangiotensin system (RAS) in spontaneously hypertensive rats (SHR) and to explore the mechanism by which benazepril protects kidney from renal interstitial fibrosis. METHODS: The animals were randomly divided into 3 groups: spontaneously hypertensive rats treated with benazepril (SHRB) group and SHR group and WistarKyoto (WKY) group. Using the methods of pathological examination and computer processing, the renal collagen area in kidney was observed. The area of collagen was examined by the image analysis system. The renal local angiotensinconverting enzyme (ACE) activity was detected by ultraviolet spectrophotography. Renal angiotensin II (Ang II) concentration was measured by radioimmunoassay. The mRNA expressions of type I and type III collagens in renal tissue were analyzed using the reverse transcriptasepolymerase chain reaction (RT-PCR). RESULTS: The area of collagen was significantly decreased in SHRB group compared to SHR group (P<0.01). The renal local ACE activities were (27.6±6.5) nmol/(min・mg) in SHRB group and (53.4±8.2) nmol/(min・mg) in SHR group and (25.3±6.9) nmol/(min・mg) in WKY group; there was a significant decrease in SHRB group as compared with SHR group (P<0.01), and there was no significant difference between SHRB and WKY groups (P>0.05). The contents of Ang II in renal local tissue were also markedly lower in SHRB group than in SHR group［(49.3±16.1) ng/g vs (83.4±8.2) ng/g, P<0.01)］. There was no significant difference between SHRB and WKY (P＞0.05). The relative levels of mRNA expressions of type I and type III collagens in renal tissue were markedly lower in SHRB group than in SHR group (P<0.01, respectively). CONCLUSION: Benazepril could attenuate rat renal fibrogenesis by inhibiting the activity of the renal RAS and decreasing collagen synthesis in renal tissue.
【Keywords】 angiotensinconverting enzyme inhibitors; reninangiotensin system; renal fibrosis; collagen
【摘要】 目的： 观察血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）对自发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rats, SHR）肾内肾素?血管紧张素系统（RAS）的影响，探讨盐酸贝那普利抗肾脏纤维化的机制. 方法： 应用病理检查、计算机分析、放射免疫、分光光度法和逆转录?聚合酶链式反应等方法，检测贝那普利组（SHRB）、SHR组（SHR）及对照WistarKyoto组（WKY）大鼠肾脏间质胶原面积、肾脏血管紧张素转换酶（ACE）活性、肾脏局部血管紧张素II（Ang II）水平及肾脏组织I，III型胶原mRNA表达. 结果： SHRB组肾脏胶原面积比SHR组明显减少（P<0.01）. SHRB组肾皮质提取液ACE活性为（28±6）nmol/（min・g），SHR组为（53±8）nmol/(min・g)，WKY组为（25±7） nmol/(min・g). SHRB组肾皮质提取液ACE活性比SHR组明显降低（P<0.01），但与WKY组相比，无显著差异. SHRB组肾皮质组织匀浆液Ang II水平为（49±16）ng/g ，SHR组为（83±8） ng/g ，WKY组为（43±14）ng/g. SHRB组肾皮质组织匀浆液Ang II水平比SHR组明显降低（P<0.01），但与WKY相比无显著差异（P＞0.05）. SHRB组肾脏组织I型胶原及III型胶原mRNA表达相对含量也均明显低于SHR组（P均<0.01）. 结论： 贝那普利可通过减少肾脏胶原的合成和抑制肾内的RAS而减轻肾脏的纤维化.
【关键词】 血管紧张素转换酶抑制药；肾素血管紧张素系统；肾脏纤维化；胶原
肾素-血管紧张素系统（RAS）除了作为一种循环内分泌系统外，亦作为一种肾脏局部内分泌、旁分泌和细胞内分泌系统，在肾脏疾病的发生发展中发挥重要作用，与肾脏纤维化关系密切. 血管紧张素Ⅱ (Ang II)是RAS中最主要的生物活性物质之一，参与肾脏损害的发生发展［1］. 研究证实，Ang II可引起血流动力学紊乱、水盐代谢失调以及促进肾脏疾病进展. 高血压终末期常常伴有肾脏损害. 因此，我们选择自发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）为实验模型，探讨血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）盐酸贝那普利对高血压肾脏纤维化的影响及其作用机制，为ACEI在减轻肾脏纤维化中的应用提供新的理论依据.
1材料和方法
1.1材料13 wk龄雄性SHR 12只以及年龄、性别匹配的WistarKyoto正常血压大鼠（WKY）6只，均由第四军医大学实验动物中心提供. 盐酸贝那普利 (诺华制药有限公司，商品名为洛汀新)；PCR引物由上海博雅生物技术有限公司合成；RTPCR试剂盒 (TaKaRa公司). 大鼠尾动脉血压测量仪(中日友好医院制造). 血管紧张素转换酶（ACE）测定试剂盒购自海军总医院. Ang II浓度的测定按中国原子能科学研究院提供的试剂盒的测定方法检测.
1.2方法
1.2.1动物分组及测压将动物共分为3组： ① WKY组（n=6）；SHR随机分为： ② SHR组（n=6）. ③ SHR+盐酸贝那普利组（SHRB组，n=6）. SHRB组每日经胃管给予盐酸贝那普利 10 mg/(kg・d)，WKY和SHR组每日经胃管给予等量的生理盐水. 共给药8 wk. 戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔麻醉，于冰上分离肾脏. 将部分肾组织中性甲醛固定后作石蜡包埋切片，其余组织液氮速冻，-80℃冰箱保存待用. 尾压法测定血压，1次/wk.
1.2.2肾组织病理检查将切片行HE染色及Masson染色，光镜下观察. Masson染色计算机图像半定量分析间质纤维化程度，胶原面积比(%)=（胶原面积/总面积）×100%.
1.2.3肾组织ACE活性测定取肾皮质组织100 mg，加入0.02 mol/L磷酸钾缓冲液2 mL匀浆，4℃, 13 000 g/min离心30 min，上述缓冲液洗涤3次. 沉淀以5 mmol/L CHAPS重新混匀，4℃过夜，4℃, 15 000 g/min离心30 min，取上清液，-20℃保存待测. 采用分光光度法测A228 nm值.
1.2.4肾脏皮质局部Ang II含量测定肾皮质称质量后，在含0.1 mol/L NaCl, 0.05 mol/L NaH2PO4, 0.05 mol/L Na2HPO4, 5 mmol/L EDTA, 5 mmol/L 8羟基喹啉的缓冲液（pH 7.4）中进行匀浆.
1.2.5肾皮质I型和III型胶原表达采用逆转录聚合酶链式反应（RTPCR）. I型胶原引物： 上游5′ TGC CGT GAC CTC AAG ATG TG 3′，下游5′ CAC AAG CGT GCT GTA GGT GA 3′, PCR产物长度为462 bp；扩增条件： 94℃，变性5 min，然后再94℃变性1 min, 60℃退火30 s, 72℃延伸30秒，共35个循环，最后72℃延伸10 min. III型胶原引物： 上游5′ AGA TCA TGT CTT CAC TCA AGTC 3′, 下游5′ TTT ACA TTG CCA TTG GCC TAG 3′，PCR产物长度为480 bp；扩增条件除退火温度为64℃以外其余与I型胶原一样. 内对照GAPDH长度为231 bp，引物： 上游5′ ACG GCA AAT TCA ACG GCA CAG TCA 3′ ，下游5′ TGG GGG CAT CGG CAG AAG G 3′. 退火温度为61℃. 所有引物均由上海博亚生物技术有限公司合成. PCR产物经15 g/L琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统（UV Transilluminator）进行图像分析测得其密度比值.
统计及处理： 实验数据均以x±s表示，各组间比较采用方差分析及LSDt检验，组间方差不齐时，采用秩和检验. P＜0.05表示有统计学意义.
2结果
2.1大鼠收缩压的变化用药后第1, 2, 4, 6, 8周，SHRB组尾动脉血压比用药前及SHR组明显降低（均P<0.01），SHRB组血压用药后第1周即开始较用药前下降（P<0.01），但与WKY相比仍较高（P<0.01）. 用药2 wk后，SHRB组血压即与WKY组无明显差别（P＞0.05, 表1）. 表1各组大鼠尾动脉血压变化
2.2肾组织的病理学改变HE及Masson染色均显示SHR组肾脏组织间质增宽，肾小管上皮细胞萎缩，成纤维细胞增生，间质和小血管周围胶原纤维环绕成网格状. SHRB组肾脏纤维化程度与SHR组相比明显减轻，胶原面积比较SHR组明显减少（P<0.01）. WKY组大鼠未见肾脏间质纤维化. WKY, SHR和SHRB3组的大鼠肾脏间质胶原面积比分别为（3.5±2.3）%, （27.3±4.2）%和（10.4±4.8）%.
2.3肾组织ACE活性的改变WKY, SHR和SHRB3组的肾皮质提取液ACE活性分别为（25±7），（53±8），（28±6）nmol/（min・g），SHRB组较SHR组明显降低（P<0.01），但与WKY相比无统计学意义.
2.4肾皮质Ang II含量的变化 WKY, SHR和SHRB组的肾皮质组织匀浆液Ang II水平分别为（43±14），（83±8），（49±16） ng/g， SHRB组较SHR组明显降低（P<0.01），但与WKY相比无统计学意义.
2.5肾皮质I型和III型胶原mRNA表达相对含量的变化WKY, SHR和SHRB3组的肾脏I型胶原mRNA/GAPDH mRNA比值分别为0.28±0.04, 1.39±0.10和0.33±0.06. 肾脏III型胶原mRNA/GAPDH mRNA比值分别为0.38±0.04, 0.85±0.09和0.39±0.11. SHRB组肾脏I，III型胶原mRNA表达相对含量均比SHR组明显下降（P<0.01），但与WKY相比无显著差异（图1）.
A： I型胶原；B： III型胶原；C： 内对照GAPDH. M: marker；WKY: WistarKyoto正常血压大鼠；SHR： 自发性高血压大鼠；SHRB： SHR+盐酸贝那普利.
3讨论
我们的研究结果显示，SHR应用ACEI治疗后，第1周尾动脉血压即明显下降，第2周血压已降至正常水平，与WKY无明显差别，此后8wk内血压均维持在正常水平. SHRB组大鼠肾间质胶原面积比明显比SHR组减少，肾脏皮质ACE活性明显降低，肾脏局部Ang II水平也明显下降. 同时，肾脏组织I，III胶原mRNA表达含量也比未治疗的SHR减少. 有研究表明肾脏局部的RAS活化可引起肾脏纤维化，此作用是通过血管紧张素1型受体（AT1）活化实现的. AT1受体与肾小管间质病变有关，肾间质成纤维细胞上也有丰富的AT1受体的表达. AT1受体与Ang II结合后，可刺激肾间质细胞产生胶原III［2］. I, III型胶原是间质型胶原的主要成分，正常肾内含有少量的I型胶原. 体外培养的大鼠系膜细胞能合成I, III型胶原. 某些细胞因子如转化生长因子β能促进体外培养的多种细胞合成胶原. 研究［3］表明，Ang II能促进肾脏表达转化生长因子β，从而使胶原合成增加. ACEI通过抑制Ang II的生成，同时也抑制了转化生长因子β的表达，使胶原合成减少. 还有研究证实，连接组织生长因子在肾脏的纤维化进程中发挥重要作用，ACEI还可使连接组织生长因子表达下调，从而抑制肾脏纤维化［4-5］.
RAS在高血压慢性肾脏损伤的发病机制中具有重要意义. RAS系统中的Ang II作为其中的重要血管活性肽不仅产生血液动力学效应，尚存在不依赖于血液动力学的多种效应，在肾脏损害方面主要表现为通过转化生长因子β促进各种肾脏固有细胞增殖，促进炎症细胞浸润与吞噬、黏附，促进肾小球细胞外基质成分增多［6］等. ACEI用于治疗高血压肾脏纤维化的机制可能有： ① 血流动力学作用： 有效降低系统高血压，同时扩张出球小动脉大于扩张入球小动脉，降低球内高压. ② Ang II能改变肾小球滤过膜孔径屏障，增加大孔物质通透性. ACEI阻断了Ang II的效应，故能减少尿蛋白的滤过. ③ ACEI可抑制细胞增殖，减少肾小球细胞外基质成分沉积，延缓肾纤维化进展. 此外ACEI尚可使血管紧张素的另一条代谢途径中具有利尿扩血管作用的Ang (1～7)水平增加，Ang (1～7)产生与Ang II相反的生理作用［7-8］.
在我们的研究中，发现SHR应用贝那普利后肾脏的胶原面积比并未完全降到正常，仍然比WKY明显增加，说明ACEI并不能完全逆转肾脏的纤维化. 可能与ACEI不能阻止RAS非经典途径产生的Ang II有关. 另外，一些细胞因子如IL1、胰岛素样生长因子、肿瘤坏死因子α、血小板衍生的生长因子和表皮生长因子可促进肾间质成纤维细胞I, III型胶原mRNA的表达，具有致纤维化作用，而ACEI并不能完全阻断这些细胞因子的表达.
【参考文献】
［1］ RuizOrtega M, Ruperez M, Esteban V, et al. Molecular mechanisms of angiotensin IIinduced vascular injury［J］. Curr Hypertens Rep, 2003,5（1）:73-79.
［2］ RuizOrtega M, Ruperez M, Esteban V, et al. Angiotensin II: a key factor in the inflammatory and fibrotic response in kidney diseases［J］. Nephrol Dial Transplant, 2006,21(1):16-20.
［3］ Wolf G, Ziyadeh FN, Thaiss F, et al. Angiontensin II stimulates expression of the chemokine RANTES in rat glomerular endothelial cells. Role of the angiotensin type 2 receptor［J］. J Clin Invest, 1997,100(5):1047-1058.
［4］ Ruperez M, Lorenzo O, BlancoColio LM, et al. The connective tissue growth factor is a mediator of angiotensin IIinduced fibrosis［J］. Circulation, 2003,108(12):1499-1509.
［5］ Esteban V, Lorenzo O, Ruperez M, et al. Angiotensin II, via AT1 and AT2 receptors and NFkappaB pathway, regulates the inflammatory response in unilateral ureteral obstruction［J］. J Am Soc Nephrol, 2004,15(6):1514-1529.
［6］ Grainger DJ. Transforming growth factor beta and atherosclerosis: so far, so good for the protective cytokine hypothesis［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2004,24(3):399-404.
［7］ Ferreira AJ, Santos RA. Cardiovascular actions of angiotensin(17) ［J］. Braz J Med Biol Res, 2005,38(4):499-507.
【关键词】百令胶囊；肾小管间质纤维化；转化生长因子-β1；α-平滑肌肌动蛋白
The effects of bailing capsules on the expression of α-SMA in the rats with tubulointerstitial fibrosis
LI Nuan,YANG Da-sheng.Department of Pediatrics,First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical College,Henan 453100,China
【Abstract】 Objective To observe the effects of bailing capsules on the expression of α-SMA in the rats with tubulointerstitial fibrosis to explore the possible mechanism of renal-protecting of bailing capsules.Methods 90 male Sprague-Dawley(SD)rats,aged three months,were randomly divided into three groups:control group(n=30),model group(n=30),treatment group(n=30).The renal tubulointerstitial fibrosis model was established by gavage with 150 mg/(kg•d)adenine solved by a solution of 2 percent starch and bailing capsules solved by normal saline was gave to the rats from treatment group in a dose of 1．5 g/(kg•d)and the same volume starch and normal saline were gave to the rats from control group.At week 7,12,17,ten rats of every group were killed,the urinary protein,N-acetyl-β-D-glucosaminidase(NAG)in the urine and renal profile including BUN and serum creatinine were examined.The histological changes of kidney were observed by light microscopy,and the expression of TGF-β1,α-SMA were examined by immunohistochemistry staining.Results At 7,12,17 weeks,the value of urinary protein,urinary NAG,serum BUN and serum Cr of rats from model and treatment group were higher than those of control one(P
【Key words】Tubulointerstitial fibrosis; Transforming growth factor-beta1; α-smooth muscle actin; Cordyceps Sinensis
在肾小管间质纤维化发生发展中肌成纤维细胞出现，并在细胞外基质过度沉积，该细胞主要表达α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)，α-SMA是肌成纤维细胞激活的指示性标志物。本实验观察百令胶囊对肾小管间质纤维化大鼠肾脏α-SMA表达的影响，探讨应用中药百令胶囊能否防治肾小管纤维化及其可能机制,现报告如下。
1 材料与方法
1．1 动物模型 选用雄性3个月龄SD大鼠90只，体质量160~210 g，购自郑州大学医学部动物试验中心。大鼠适应环境1周后，随机分为对照组(30只)，模型组(30只)，预防组(30只。模型组参考文献[1]，将腺嘌呤以2%淀粉溶液溶解，制成混悬液，以150 mg/(kg•d)灌胃，连续17周，制作大鼠肾小管间质纤维化模型；预防组以150 mg/(kg•d)腺嘌呤灌胃，同时以1．5 g/(kg•d)百令胶囊溶于生理盐水灌胃，对照组以腺嘌呤相同体积淀粉和百令胶囊相同体积生理盐水灌胃，分别于实验第7、12、17周时各组随机处死10只大鼠。取肾脏，经10%多聚甲醛固定，光镜下观察肾组织的病理变化和免疫组织化学法检测肾脏转化生长因子-β1(transforming growth factor-beta1,TGF-β1)、α-SMA的表达情况。处死前取血，并于各时相点前1 d分别将各组10只大鼠放入代谢笼中留取24 h尿液，进行生化指标检测。
1．2 生化指标检测 血清肌酐(creatinine,Cr)和尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)采用BECKMAN CX-7全自动生化分析仪测定；24 h尿蛋白定量采用考马斯亮蓝法；尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(N-acetyl-β-D-glucosaminidase，NAG)酶采用比色法。
1．3 肾脏组织病理 肾组织HE染色和Masson特染，光镜观察。在IDA-2000高清晰度数码显微图像分析系统下计算肾小管间质纤维化指数。高倍镜(×200)下随机选取10个不重叠视野测定小管间质纤维化面积与同视野小管间质总面积的百分比，进行半定量评分[2]。评分标准：0分：无病变； 1分：50%。每张切片取10个视野的平均积分，再在各组取平均值。
1．4 免疫组化 采用链霉亲和素-生物素-过氧化物酶(SABC)法检测肾组织中的TGF-β1和α-SMA，操作步骤按SABC试剂盒说明书进行。光镜下组织切片呈棕黄色颗粒性沉积区域为阳性染色部位。TGF-β1和α-SMA染色结果在高倍镜(×200)下随机选择20个不重叠的视野，采用半定量评分[3]。TGF-β1半定量评分标准：0分：无染色；1分：染色面积
1．5 统计学方法 各组数据均采用均值±标准差(x±s)表示，组间比较采用两组独立样本的t检验(双侧)和方差分析，由SPSS 10．0统计软件进行统计学处理。
2 结果
2．1 生化指标检测 实验大鼠24 h尿蛋白、尿NAG酶、血BUN、Cr含量变化,见表1。
2．2 肾脏组织病理改变 对照组肾小管间质基本正常。实验7周时，模型组和预防组大鼠肾脏肾小管扩张，间质单核细胞浸润、水肿，可见间质纤维组织灶性增生。12周时，模型组和预防组肾小管扩张明显，肾小管上皮空泡或颗粒性变性，基底膜断裂，小管间质区域增宽，纤维化明显。17周时，模型组和预防组两组大鼠肾脏病理检查均可见肾小管明显萎缩及消失，间质广泛纤维化。7、12周时，预防组大鼠肾脏病理改变均较模型组轻。17周时，模型组和预防组大鼠肾脏病理改变差异无统计学意义(P=0．670)。各时相点，各时相点模型组和预防组大鼠肾间质损害半定量分析见表2。
2．3 肾组织免疫组化变化（TGF-β1、α-SMA），见表3。
3 讨论
肾小管间质纤维化的发生是个复杂的病理生理过程，其机制尚未完全清楚。1952年，Philips建立腺嘌呤致大鼠肾功能衰竭模型,现已成为研究肾小管间质纤维化病理机制的理想动物模型。本实验以腺嘌呤150 mg/(kg•d)灌胃1次，连续17周。实验第7周时，模型组尿蛋白排泄量、尿NAG酶水平高于对照组。病理改变显示，肾小管有沉积物出现，肾皮质出现异物肉芽肿，灶性小管扩张、间质单核细胞浸润、轻度纤维组织增生，而此时血BUN、Cr 水平和对照组比较无明显差异。随着时间的推移，病情的进展，至12周时，模型组血BUN、Cr等指标进一步增高，肾脏病理改变进一步加重，小管萎缩、扩张，间质纤维组织明显增加。17周时，模型组肾功能明显减退，间质大量纤维组织增生，肾小管结构消失。模型组大鼠肾脏TGF-β1表达量呈增加趋势，实验结果显示，肾小管间质纤维化动物模型制作是成功的，和楚非[1]报道相似。
据文献报告，肾间质纤维化的主要表现有肾脏固有细胞消失、肌成纤维细胞增多、细胞外基质沉积等[4]。肌成纤维细胞在纤维化肾组织的广泛存在及其在的重要意义已为众多实验所证实。所谓肌成纤维细胞是形态上介于成纤维细胞和平滑肌细胞之间的细胞，该细胞表达α-SMA。在人肾组织研究中，发现肾小管间质内α-SMA表达量与肾小管间质纤维化的程度以及肾功能恶化程度呈正相关关系[5]。有文献报道，在实验大鼠肾小管受损和肾间质纤维组织增生较明显区域检测到了α-SMA阳性细胞，表明肌成纤维细胞的积聚发生在纤维组织增生较明显部位，肌成纤维细胞在肾小管间质纤维化中发挥着重要作用，且与肾脏功能有一定相关关系[6-10]。本实验免疫组化结果显示，模型组7周时α-SMA表达已明显增多，12、17周时α-SMA表达量进一步增加。α-SMA的变化与肾病理、肾功能、尿蛋白的变化相一致，即α-SMA高表达者，其病理重、SCr、BUN、尿NAG或尿蛋白值就高。本实验的结果提示，在腺嘌呤致大鼠肾小管间质纤维化模型中，随着病情的进展，α-SMA表达量增加，肾脏病理变化越来越重，标志肌成纤维细胞产生，促进肾小管间质纤维化的发生。预防组血Cr、血BUN、尿NAG及24 h尿蛋白值在第7周时与模型组比较无明显差异，第12周时均低于模型组，并且可见细胞浸润、小管细胞空泡变性及细胞坏死减少。预防组大鼠肾脏TGF-β1表达量均较模型组少，提示百令胶囊治疗对肾小管上皮细胞有保护作用，能有效地改善大鼠的肾损害，减轻肾小管间质纤维化。笔者的实验结果显示预防组大鼠肾脏α-SMA表达量均较模型组少，提示百令胶囊可能通过下调α-SMA表达，抑制肌成纤维细胞增多，使细胞外基质沉积减少，延缓肾小管间质纤维化而发挥其肾脏保护作用。
参考文献
［1］ 楚非,邹万忠,孙锁柱,等.大鼠肾小管间质纤维化中肾小管上皮细胞表型转化的研究.中华肾脏病杂志,2003,19(1):10-14.
［2］ Mezzano SA,Droguett MA,Burgos ME,et al.Overexpression of chemokines,fibrogenetic cytokines,and myofibroblasts in human membranous nephropathy.Kidney Int,2000,57:147-158.
［3］ Mizuno S,Matsumoto K,Nakamura T.Hepatocyte growth factor suppresses interstitial fibrosis in a mouse model of obstructive nephropathy.Kidney Int,2001,59:1304-1314.
［4］ Ng YY,Huang TP,Yang WC,et al.Tubular-epithelial-myofibroblasts transdifferen-tiation in progressive tubuloinstitial fibrosis in 5/6 nephretomized rats.Kidney Int,1998,54:864-876.
［5］ 陈楠,王伟铭.肾小管间质纤维化机制及防治进展.肾脏病与透析肾移植杂志,2001,10(6):551-552.
［6］ 刘清娟，何宁，刘淑霞,等.糖尿病大鼠肾小管上皮细胞转化与肝细胞生长因子和Smad7蛋白的表达.中国危重病急救医学，2005，17(11)：675-678.
［7］ 易春霞，廖海强，周于禄,等.替米沙坦对糖尿病肾病大鼠肾脏α-SMA表达影响的实验研究.中南医学,2006，4(4):259-261.
［8］ 陈威，杨守京，刘彦仿，等.实验性慢性肾缺血模型肾小管-间质细胞α-平滑肌肌动蛋白的表达和意义.肾脏病与透析肾移植杂志,2004,13(1):30.
［9］ 王瑞英，姚敏，王绵,等.2型糖尿病大鼠肾小管上皮细胞中α-SMA的表达及其与肾功能的关系.中国老年学杂志，2006，26(5):647-649.
[关键词] 肾间质纤维化；中药疗法
[中图分类号] R692[文献标识码] A[文章编号] 1673-7210（2012）04（b）-0016-03＼
在慢性肾脏病的进展过程中，肾小球硬化和肾间质纤维化起着重要作用。而众多研究表明：肾间质纤维化在肾脏疾病发展传变过程中起主要作用，其病变程度与慢性肾脏病预后紧密相关。肾间质纤维化几乎是各种肾脏疾病进展到终末期肾衰竭的必经之路[1]。因此，关于肾间质纤维化的发生机制及其防治手段的研究成为了现代国际肾脏病学研究的热点之一。肾间质纤维化的发生机制错综复杂，涉及细胞、细胞外基质和生长因子之间的相互作用。在西医治疗肾间质纤维化未取得突破性进展的同时，中医药学者在防治本病方面进行了大规模药理研究。在此研究过程中发现，很多中药有着抗肾间质纤维化的作用。笔者仅就中药抗肾间质纤维化研究进展研讨如下：
1 肾间质纤维化发生机制
1.1 抑制肾间质成纤维细胞增殖、活化、促进其凋亡
成纤维细胞是肾间质纤维化的主要效应细胞。正常情况下，间质中的成纤维细胞处于静止状态，在致病因子作用下，活化为肌成纤维细胞（MFB），表达α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA），产生大量的纤维连结蛋白（FN）和胶原，造成细胞外间质（ECM）增多，同时成纤维细胞凋亡减少也造成肾间质纤维化。
1.2 细胞因子的作用
TGF-β被公认为最重要的致纤维化因子[2]。目前研究显示TGF-β有三个亚型，并一致认为治疗肾纤维化的靶点是TGF-β1。在肾间质纤维化发生发展中TGF-β起到以下几方面作用：①刺激成纤维细胞增加细胞外基质的合成。②在抑制各种细胞外基质降解酶活性的同时，ECM的降解受到了抑制。③刺激肾小管上皮细胞分化为肌成纤维细胞等。④增加细胞外基质受体，使细胞外基质和细胞的相互作用增强。另有资料显示，作为介导TGF-β1促纤维化的下游因子的结缔组织生长因子（CTGF），具有促细胞外基质合成和细胞增生的单一生物学效应。因此，有很多学者将目光投向药物干预CTGF的表达，以期达到抗肾间质纤维化作用。
1.3 细胞外基质转换失衡
导致肾间质纤维化的重要原因是ECM在肾间质的过度沉积。ECM降解受抑是肾间质纤维化的形成机制之一[3]。基质金属蛋白酶是体内重要的ECM降解系统。金属蛋白酶组织抑制剂或纤溶酶原激活物抑制剂的过度表达，有利于间质ECM成分积聚，促进纤维化的发展。
由此可见，细胞的活化、细胞因子的释放及细胞外基质在肾脏的沉积，三者相互影响，在肾间质纤维化发生发展中起着重要的作用。
2 单味中药及其有效提取物抗肾间质纤维化研究
2.1 红花
许庆友等[4]用单侧输尿管结扎法（UUO）诱导肾间质纤维化的动物实验观察到红花可以抑制UUO大鼠肾脏α-SMA和Ⅳ型胶原的表达，从而拮抗肾间质纤维化的进展。高燕等[5]的动物实验证实了红花黄色素对大鼠肾间质纤维化病变具有明确的保护作用，而此作用可能是因为促纤维化因子TGF-β1的表达受抑，Ⅰ型胶原在肾间质的沉积减少，进而减少ECM过度积聚，延缓了肾间质纤维化的进展。
2.2 莪术
刘迟等[6]观察到莪术可能由其抑制了促纤维化因子TGF-β1，核因子NF-κb，阻止肌纤维细胞的出现，下调纤溶酶原激活物抑制剂-1来抑制成纤维细胞活性，抑制ECM合成，并促进其降解来延缓肾间质纤维化的发展。
2.3 川芎
陆敏等[7]研究发现川芎嗪可通过降低肾组织中TGF-β1含量及恢复由于降解减少的Smad 7以及其转录共抑制因子（SnoN）蛋白水平来阻断肾间质纤维化的发生与发展。笔者通过钻研文献发现，多数中医学者认为肾间质纤维化的病因病机为虚、瘀、毒。而瘀为本病的主要病理基础。因此活血化瘀药物在肾间质纤维化疾病的研究领域中展现了优势。而红花、莪术、川芎为此中代表，并通过研究证明以上中药可有效延缓肾间质纤维化的发生与发展。
2.4 杜仲
丁庆余等[8]观察到杜仲与ARB类药物相比，同样能明显降低SMA和FN的表达，从而改善肾间质纤维化。
2.5 三七
韦颖等[9]研究表明：三七总皂苷可明显抑制人肾成纤维细胞增殖及Ⅰ型胶原的分泌。可以证实三七总皂苷确有体外抗肾间质纤维化作用。中药三七一直以来被广泛应用于心血管系统及神经系统疾病的治疗，直至近年来有研究者发现三七具有抗肝纤维化的作用，才使得更多研究者相信该药有抗肾间质纤维化的可能，并在实验研究中证实了三七抗肾间质纤维化的作用及相关机制。
2.6 黄芩
谢红东等[10]实验发现以黄酮为主的黄芩提取物干预“经氯化汞灌胃法制成的大鼠肾纤维化模型”后肾组织抗氧化能力明显提高，且成一定量效关系，同时该氧化损伤作用是黄芩提取物抗肾纤维化的重要机制。以往我们对黄芩的药理作用多局限在其抗炎及抗病毒方面，但众多观察表明该药具有抗肝纤维化、抗肺纤维化等作用。而机体各器官的纤维化病理机制多相似。故笔者有理由相信黄芩有望在抗肾间质纤维化方面有所斩获。
2.7 黄蜀葵花
冯媛等[11]通过实验证实黄蜀葵花总黄酮对肾间质纤维化大鼠的保护机制为黄葵总黄酮可降低肾组织CTGF和OPN的表达，上调肾组织Smad 7和Smad核转录共抑制因子SnoN蛋白表达水平。从而有效延缓肾间质纤维化进展。越来越多的研究者将目光投向单味中药抗肾间质纤维化的治疗领域，笔者总结发现各类中药中仍以活血化瘀药物治疗本病疗效最佳。
3 中药复方抗肾间质纤维化研究
3.1 丹参红景天合剂
周萍[12]采用UUO法建立肾间质纤维化大鼠模型，观察丹参红景天合剂对大鼠肾间质纤维化CTGF表达的影响。结果显示：该药能下调CTGF的表达，阻止成纤维细胞及肾小管上皮细胞的增殖和活化，进而减轻肾间质纤维化。中药丹参可活血养血，而一些医家的研究表明在抗肾间质纤维化治疗中丹参已初显疗效。而近年来国内外的药学工作者对红景天的研究结果显示红景天具有类似人参“扶正固本”的作用，而且在某些方面还优于人参。将两药制成合剂，取其活血化瘀，益气扶正之功。相信此药在抗肾间质纤维化治疗中定可实现“1+1＞2”的理论。
3.2 黄芪当归合剂
孟立强等[13]研究证实黄芪当归合剂的肾保护作用从病变早期开始，主要表现为减少炎症细胞反应和TGF-β1表达。随后可减少肾脏固有细胞转化、分化及ECM成分沉积，其作用的高峰时间是在3~7 d，并持续存在10 d，进而减轻肾间质纤维化的发生发展进程。笔者认同“虚”为肾间质纤维化中医病机之根本。而黄芪善治诸虚不足；当归补血活血，用于血虚诸证，两者相结合，气血双补，共凑“正气存内，邪不可干”之功。故黄芪当归合剂为补益药有效抗肾间质纤维化之复方制剂的代表。
3.3 虫草肾茶颗粒
马晓鹏等[14]动物实验发现虫草肾茶颗粒可以部分降低单侧输尿管结扎引起的肾组织NF-κb的高表达，并能明显下调CTGF表达水平，从而部分抑制肾间质纤维化的发生，保护肾脏功能。
3.4 肾康注射液
乔颖进等[15]综合细胞学实验及动物实验研究结果，证实肾康注射液可能通过下调TGF-β1、CTGF高表达而抑制ECM合成，并下调纤溶酶原激活物抑制剂-1，金属蛋白酶组织抑制剂-1高表达而促进ECM降解，起到拮抗肾间质纤维化及改善肾功能的作用。
3.5 肾炎康复片
叶婷婷等[16]实验证实：肾炎康复片可以下调FN和基质金属蛋白酶抑制剂-1（TMP-1）在UUO大鼠肾间质中的表达，从而延缓肾间质纤维化的进展。中药在临床应用当中，更多的是以复方形式出现，因药物之间经合理配伍后可增强疗效同时又能明显减轻可能带来的毒副作用。笔者认为复方制剂治疗肾间质纤维化将有更广阔的应用前景。
4 讨论
肾间质纤维化发病机制错综复杂，而现代医学虽已开始采用下调TGF-β1的表达来干预肾间质纤维化的发生与发展，并进行大量相关研究。但肾间质纤维化是一个多渠道、多环节的进展过程，目前研究显示孤立靶点对其进行干预的效果并不理想，需着眼于多靶点的治疗手段。而中药成分及药物间配伍的多样性和作用于多环节的特点，在防治肾间质纤维化领域中日益突显强大优势。中医理论认为肾间质纤维化的病机关键是虚、瘀、毒。而虚是病机之根本，故众多医家对补虚药如黄芪、红景天、杜仲、当归等展开了药理及动物实验研究，并证实了很多补虚药均有抗肾间质纤维化作用且疗效确切。而一些以补虚立法的复方制剂如“黄芪当归合剂”等更是经过动物实验证明可明显下调促纤维化因子TGF-β1的表达，减少ECM过度沉积，延缓肾间质纤维化进程。“瘀”是肾间质纤维化的主要病理基础。中医活血化瘀药物具有不同活血力度，其中有养血活血药如川芎等；活血化瘀药如丹参、桃仁、红花等；破血祛瘀药如莪术、水蛭等，其中大多已被实验研究证实具有抗肾间质纤维化功效。而更有研究者将补虚祛瘀两大法则相结合，取扶正祛邪、标本兼治之法干预肾间质纤维化的进展，并获得较满意疗效，如丹参红景天合剂等。大量研究证实：中药延缓肾间质纤维化的发生发展是通过减轻肾间质损伤指数，下调促纤维化因子在肾脏组织的表达，或可诱导抗纤维化因子的产生，减少ECM的过度沉积等机制来实现的。众所周知，各种原因引起的慢性肾脏病经发展均可伴有不同程度的肾功损害。而进行性肾功能恶化主要取决于肾间质纤维化的严重程度。因此，对抗肾间质纤维化的治疗，对于延缓肾功衰竭进展具有深远意义。笔者认为，未来研究找准切入点，紧密将中医药理论与先进的现代科学研究方法相结合，有力防治肾间质纤维化，将开启防治慢性肾脏病及其并发症的新篇章。
[参考文献]
[1]Eddy AA. Molecular basis of renal fibrosis [J]. Pediatr Nephrol，2000，15（3-4）：290-301.
[2]Yang J，Liu YL. Dissection of key events in tubular epithelical to myfibroblast transition and its implication in renal interstitial fibrosis [J]. Am J Pathol，2001，159（4）：1465-1475.
[3]Razzzque MS，Taguchi T. Cellular and molecular events leading to renal tubulointerstitial fibrosis [J]. Med Electron Microsc，2002，35（2）：68-80.
[4]许庆友，潘莉，王月华，等.红花对肾间质纤维化实验大鼠肾小管上皮细胞表型转化的抑制作用[J].中国老年学杂志，2009，29（11）：1344-1346.
[5]高燕，陈航，贾海红，等.红花黄色素对实验性肾间质纤维化大鼠TGF-β及Ⅰ型胶原表达的影响[J].医学研究与教育，2009，6（3）：11-13.
[6]刘迟，郭刚，胡仲仪.莪术对单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化的影响[J].上海中医药杂志，2006，40（12）：71-73.
[7]陆敏，周娟，王飞，等.川芎嗪对肾间质纤维化模型大鼠Smad 7和SnoN蛋白表达的影响[J].中国中药杂志，2009，34（1）：84-87.
[8]丁庆余，宋恩峰，贾汝汉.杜仲对单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化的影响[J].中国中西医结合肾病杂志，2010，11（2）：109-111.
[9]韦颖，樊均明，潘丽萍.三七总甙对人肾成纤维细胞的影响[J].中国中西医结合杂志，2002，22（1）：47-49.
[10]谢红东，杨珂，穆焕德，等.黄芩提取物对大鼠肾间质纤维化的作用及其抗氧化机制[J].中国中西医结合肾病杂志，2009，10（3）：240-242.
[11]冯媛，刘敏，张苗，等.黄蜀葵花总黄酮对单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化的影响[J].中国中西医结合肾病杂志，2010，11（11）：1006-1008.
[12]周萍.丹参红景天合剂对大鼠肾间质纤维化CTGF表达的影响[J].中国医药导报，2008，5（4）：27-28.
[13]孟立强，屈磊，李晓玫.黄芪当归合剂对肾间质纤维化的多靶点抑制作用[J].中国药理学通报，2006，22（3）：296-302.
[14]马晓鹏，宋立群，于思明，等.虫草肾茶颗粒对单侧输尿管结扎致肾间质纤维化大鼠肾脏影响的研究[J].中国临床保健杂志，2010，13（4）：385-388.
[15]乔颖进，谌贻璞，芮宏亮，等.肾康注射液对慢性马兜铃酸肾病模型大鼠肾间质纤维化的拮抗作用[J].中草药，2009，40（4）：587-592.
[关键词] 血管紧张素Ⅱ；肾间质纤维化；转化生长因子β1
[中图分类号] R692.33 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）01（b）-0029-04
The mechanism of action for AngiotensinⅡ in renal interstitial fibrosis
CHENG Huan CHEN Xinghua DING Guohua
Department of Nephrology， Renmin Hospital of Wuhan University， Hubei Province， Wuhan 430060， China
[Abstract] The cause of progression for chronic kidney disease （CKD） is multifactorial. Renal interstitial fibrosis characterized by the accumulation of extracellular matrix （ECM）， is a better reveal of progression for CKD， compared to glomeruli damage. The activation of the renin-angiotensin system （RAS） is a key factor for renal interstitial fibrosis. Angiotensin Ⅱ （AngⅡ）， the main effector of RAS， is a critical promoter of fibrogenesis， the mechanisms underlying its profibrogenic effects are complex. A better understanding of the effects of AngⅡ for renal interstitial fibrosis， will contribute to developing better strategies for the CKD.
[Key words] Angiotensin Ⅱ； Renal interstitial fibrosis； Transforming growth factor-β1
肾素-血管紧张素系统（RAS）慢性激活参与了肾间质纤维化发生，加剧了慢性肾脏病的进展[1]。肾间质纤维化是慢性肾脏病的特征，主要表现为肾小管的缺失和萎缩，由肌成纤维细胞产生的细胞外基质（ECM）的积聚。RAS阻滞剂也能够通过多种机制发挥抗肾脏w维化效应。AngⅡ作为RAS的核心成分，是肾脏纤维化发生的关键环节。AngⅡ不仅能够影响肾脏血流动力学，而且通过多种机制调节肾脏细胞生长、炎症和细胞因子产生、细胞外基质积聚与降解，从而加速肾间质纤维化[2]。本文就此做一综述。
1 AngⅡ与AngⅡ受体（ATR）
ATR包括血管紧张素Ⅱ1型受体（AT1R）、血管紧张素Ⅱ2型受体（AT2R）。AngⅡ介导纤维化的功能主要与AT1R有关，AngⅡ诱导的ATIR激活，介导了转化生长因子β1（TGF-β1）、结缔组织生长因子（CTGF）和缺氧诱导因子（HIF-1α）等促纤维化通路。AT2R在胚胎时期的各组织中表达丰富，出生后大多数组织器官AT2R减少或消失。而AT2R发挥的生物学活性多与AT1R相拮抗，且通常后者起主导作用[3]。大量体内外研究证实，ATR拮抗剂能够抑制肾间质纤维化进展[4-5]。也有研究发现，在单侧输尿管梗阻（UUO）模型中，巨噬细胞表面的AT1R通过增强巨噬细胞吞噬能力，或者通过抑制白细胞介素-1（IL-1）活性发挥保护肾脏纤维化作用。给予ATR拮抗剂后，肾间质浸润巨噬细胞减少、巨噬细胞吞噬能力减弱。巨噬细胞表面AT1R缺失后，肾间质纤维化加重[6-7]。因此，AT1R在巨噬细胞表面的抗肾纤维化作用，有望被运用于克服ATR受体拮抗剂类药物副作用和对造血细胞损害的缺陷。
2 AngⅡ与TGF-β1
TGF-β1是一种具有多生物学活性的细胞因子，在调节细胞外基质代谢、参与间质纤维化等方面发挥重要作用。AngⅡ和TGF-β1之间的交互作用多重复杂，是肾间质纤维化的重要环节。AngⅡ可以通过直接调控特异性转录序列激活TGF-β1基因转录[8]，还可以间接通过单核细胞趋化因子蛋白1（MCP1）表达增强，或者通过p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）信号通路激活血小板反应蛋白1（TSP-1）[9]，最终导致TGF-β1表达增多。TGF-β1信号通路的激活是细胞外基质沉积的主要通路。在糖尿病肾病大鼠模型中抗TGF-β1受体与血管经张素转化酶抑制剂（ACEI）联合运用能够缓解间质炎症和Ⅱ型胶原蛋白（COL-Ⅱ）积聚。在肾间质纤维化中，肾小管上皮间质转化（EMT）是肌成纤维细胞来源之一，后者是产生细胞外基质的主要来源[10]。Fan等[11]发现，以TGF-β1刺激大鼠肾小管上皮细胞（NRK52E）后，表现出了细胞肥大、微绒毛消失、细胞伸长等形态学改变，并伴随上皮细胞标志物E-钙黏蛋白（E-cadherin）减少、肌成纤维细胞激活的标志物α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）增多等表型改变。TGF-β1是EMT的重要介质，AngⅡ介导EMT也是通过这一介质。TGF-β1/smad信号通路发挥促纤维化作用主要是通过调节下游介质smad2和smad3。smad7在体内外实验中被证实是一种TGF-β的负性调节蛋白。转染或者过表达smad7导致CTGF、纤连蛋白、Ⅰ型胶原蛋白（COL-Ⅰ）表达下调，从而抑制肾纤维化[12]。Yang等[13]发现，AngⅡ刺激NRK52E后，可以通过AT1R激活smad2/3，并且诱导EMT。TGF-β1也能够通过激活smad2/3，诱导smad7的表达，后者通过负反馈调节机制抑制smad2/3磷酸化，从而抑制TGF-β1介导的纤维化。因此，下调smad7能够激活smad2/3，并促进肾脏纤维化，即smad2/3和smad7之间的负平衡是肾纤维化的关键机制[14]。而Yang等[13]研究发现，smad7降解主要是通过AT1R-Smurf2依赖的泛素降解机制，通过AT1R阻滞剂或者下调Smurf2减少smad7的降解，能够抑制smad2/3的激活和EMT。在AngⅡ介导的肾纤维化中，除了TGF-β1依赖的smad信号通路，AngⅡ介导血管纤维化可以通过ERK/p38MAPK-smad交互作用，而不依赖于TGF-β1。AngⅡ刺激人肾小管上皮细胞（HK-2）后，独立于TGF-β1的smad信号通路可以迅速被激活，而TGF-β1介导的smad转录发生于24 h之后。因此，在AngⅡ诱导的肾间质纤维化，阻断smad信号通路可以成为抗纤维化的重要靶点。
3 AngⅡ与结缔组织生长因子（CTGF）
CTGF是一种富含半胱氨酸的多肽，属于CCN家族成员之一，具有多种生物活性，包括调节细胞凋亡和增殖、趋化细胞、促纤维化等。在生理情况下，机体组织细胞可有少量CTGF基础分泌，但是肾小球硬化、糖尿病肾病等肾脏疾病中表达升高，并且它的表达水平与肾纤维化的进展和严重程度呈正相关。在AngⅡ灌注的大鼠肾小球、小管、肾动脉，CTGF表达量升高，并伴随纤连蛋白的沉积。予AT1R拮抗剂处理后，CTGF、纤连蛋白表达减少[15]。在培养的肾脏细胞（系膜、小管上皮细胞），AngⅡ通过ATIR增加CTGF mRNA和蛋白表达。CTGF反义寡核苷酸（CTGF-AS）能够抑制AngⅡ刺激后HK-2向肌成纤维细胞的转分化，从而减轻诱导的肾间质纤维化[16]。TGF-β1因其具有抑制细胞生长、免疫抑制等生物学活性，单纯被抑制后，不可避免地带来免疫失调等副作用。CTGF是TGF-β1下游介导纤维化的蛋白，成为新的抗纤维化治疗靶点。在TGF-β1基因缺陷的肾小管上皮细胞，AngⅡ也能够诱导CTGF、COL-Ⅰ的快速激活。在培养的大鼠系膜细胞，IL-1β通过下调CTGF抑制AngⅡ诱导的Ⅳ型胶原蛋白（COL-Ⅳ）的生成从而改善肾间质纤维化[17]。因此，不仅作为TGF-β1下游信号，CTGF的上述作用为在临床上找到安全、有效延缓肾脏纤维化途径提供新的思路。
4 AngⅡ与表皮生长因子受体（ECGR）
EGFR是ErbB家族成员的酪氨酸激酶受体。EGFR具有N端细胞外配体结合区域，一个保守的α螺旋跨膜区域，和一个C端细胞质区域，拥有酪氨酸激酶活性和磷酸化位点。磷酸化后，EGFR能够刺激细胞生长，抑制细胞凋亡，调节血管生成。在急性肾脏损伤后EGFR是小管上皮细胞再生修复的重要保护因子，然而EGFR持续激活在梗阻性肾病等慢性肾脏病中是有危害的。EGFR在AngⅡ诱导的纤维化中扮演重要角色。Grimminger等[18]发现，AngⅡ本身不能刺激细胞有丝分裂，但是可以放大EGR介导的促增殖效应。Chen等[19]发现，肝素结合性表皮生长因子（HB-EGF）通过EGFR自身磷酸化生成，并伴随TGF-β信号通路的激活，从而介导AngⅡ诱导的肾小管上皮细胞肥大。Lautrette等[20]研究发现，表达EGFR阴性的转基因小鼠，AngⅡ灌注2个月后，不能激活EGFR或者下游的激酶。AngⅡ灌注基因突变小鼠与野生型小鼠相比，表现出明显少量的蛋白尿，但是测得的血压却无差异[20]。另外发现，在小鼠系膜细胞，AT1R激活能够诱导EGFR活化，及下游PI3K和MAPK信号通路激活，从而调控TGF-β mRNA水平[20]。Qian等[21]研究发现，AngⅡ通过c-scr反式激活EGFR，从而进一步激活细胞外调节蛋白激酶（ERK）和Akt信号通路和诱导TGF-β/smad通路和纤维化基因的表达。在Ang2刺激的体内外实验中，EGFR阻滞剂能够显著抑制ERK和Akt活性。因此，以EGFR为靶点的药理途径有望成为治疗慢性肾脏病新的方式。
5 AngⅡc低氧诱导因子-1α（HIF-1α）
HIF-1α是一种低氧条件下被激活的转录因子。脯氨酸羟化酶（PHD）是HIF降解反应的限速酶，可羟基化HIF的脯氨酸残基。在常氧条件下，HIF-1α在PHD作用下羟基化，迅速降解；在低氧条件下，氧敏感的PHD催化活性被抑制，HIF-1α表达增多。在许多急性肾损伤模型中HIF-1α的表达上调具有肾脏保护作用，然而在慢性肾脏病中，在低氧条件下，HIF-1α能够转录激活一系列低氧相关的基因，使细胞和组织适应低氧应激环境。HIF-1α长期激活对肾脏是有害的。体内外实验证实，HIF-1α基因的激活在AngⅡ介导的肾间质纤维化中发挥关键作用。在肾髓间质细胞，AngⅡ通过刺激H2O2生成，抑制了PHD2活性，激活HIF-1α，介导纤维化的发生[22]。Sánchez-López等[23]研究发现，AngⅡ诱导的体内外肾脏损伤实验中，AngⅡ通过HIF-1α的激活诱导内皮细胞生长因子（VEGF）表达上调，从而参与慢性肾脏疾病进展，活性氧（ROS）作为第二信号介导HIF-α生成。AngⅡ灌注导致肾脏HIF-1α激活和氧化应激，并且这种效应能够被抗氧化剂阻断。AngⅡ激活参与了糖尿病肾病发病机制，AT1R能够延缓疾病进展。在链脲菌素诱导的糖尿病肾病大鼠模型，AT1R受体拮抗剂缬沙坦通过抑制金属蛋白酶组织抑制剂（TIMP）、内皮素1（ET1）抑制HIF-1α活性，从而减轻肾脏的损伤[24]。基质金属蛋白酶（MMP）是降解细胞外基质的主要酶，ET1参与肾间质纤维化主要与间质成纤维细胞增殖有关。在体外肾脏髓间质细胞，AngⅡ刺激后HIF-1α的表达显著升高，并且伴随着显著的COL-Ⅰ/Ⅱ、促纤维化因子TIMP-1的上调，HIF-α siRNA也能够阻断AngⅡ诱导的增殖细胞核抗原（PCNA）和波形蛋白的上调，前者是细胞增殖的标志，后者是转分化EMT的标志。基因沉默HIF-1α能够抑制AngⅡ诱导的促纤维化因子TIMP-1、COL-Ⅰ/Ⅱ、PNAC、波形蛋白等的转录[22]。HIF-1α也能够通过AngⅡ介导的血流动力学改变参与肾脏纤维化。AngⅡ通过毛细血管内皮细胞结构和功能的改变，导致管周毛细血管网减少，肾间质缺氧，诱导了HIF-1α的生成，促进肾间质纤维化。
6 AngⅡ与MicroRNA（ miRNA）
miRNA是一类由21～25个核苷酸组成非编码单链小分子RNA，其通过碱基配对与mRNA分子的3'非翻译区相结合，来降解mRNA或者抑制靶基因翻译，从而在转录后水平调控基因表达，参与了细胞生长、增殖、发育、肿瘤发生等多种疾病的发生发展过程。最近许多学者提出肾小管间质纤维化与这些miRNAs的丢失或者激活相关。miR-200家族包括miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429。在Xiong等[25]构建的UUO模型中观察到，miRNA-200家族的下调，锌指E-盒结合同源异形盒-1（ZEB1）和锌指E-盒结合同源异形盒-1（ZEB2）作为E钙黏蛋白转录抑制子的抑制作用被解除，启动了EMT及纤维化过程，从而为慢性肾脏病提供了新的治疗靶点。在用MWF大鼠构建的终末期肾脏病模型，ACEI能够通过调控miR-324-3p/Prep通路发挥保护肾间质纤维化的作用。脯氨酰肽内切酶（Prep）是miR-324-3p下游的目的蛋白，参与到Ang-Ⅰ/AngⅡ到Ang-（1～7）的代谢转化[26]。转录因子Ets-1在纤维化的肾脏中，表达上调。在AngⅡ刺激的大鼠肾成纤维细胞（NRK-49F），miRNA221表达下调，予miRNA221抑制剂处理后，Ets-1表达增多，NRK-49F活化[27]。Pan等[28]研究发现，AngⅡ刺激NRK-52E后，miRNA29b表达减少，转染miRNA29b抑制剂后TGF-β1、α-SMA、COL-Ⅰ表达增多，说明miRNA29b参与AngⅡ介导的EMT。
最终AngⅡ通过ATIR调控肾小管上皮细胞、周细胞、间质成纤维细胞、循环中骨髓来源的成纤维细胞的激活并转分化成为肌成纤维细胞[29]，后者产生ECM，在小管间质积聚，纤维化发生。现在针对于AngⅡ作用的ACEI、血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂（ARB）已用于临床慢性肾脏病的治疗，然而却不能完全阻断肾间质纤维化进展。因此，smad信号通路、CTGF、miRNAs、EGFR、PHD/HIF-1α等有望成为拮抗AngⅡ的新的物治疗靶点，从而运用于慢性肾脏病的防治。
[参考文献]
[1] Eddy AA，Neilson EG. Chronic kidney disease progression [J]. J Am Soc Nephrol，2006，17（11）：2964-2966.
[2] Border WA，Noble NA. Interactions of transforming growth factor-beta and angiotensin Ⅱ in renal fibrosis [J]. Hypertension，1998，31（1 Pt 2）：181-188.
[3] Suzuki K，Han GD，Miyauchi N，et al. Angiotensin Ⅱ type 1 and type 2 receptors play opposite roles in regulating the barrier function of kidney glomerular capillary wall [J]. Am J Pathol，2007，170（6）：1841-1853.
[4] Hosojima M，Sato H，Yamamoto K，et al. Regulation of megalin expression in cultured proximal tubule cells by angiotensin Ⅱ type 1A receptor- and insulin-mediated signaling cross talk [J]. Endocrinology，2009，150（2）：871-878.
[5] Andersen S. Angiotensin Ⅱ receptor blockade in diabetic nephropathy [J]. Dan Med Bull，2004，51（3）：274-294.
[6] Nishida M，Fujinaka H，Matsusaka T，et al. Absence of angiotensin Ⅱ type 1 receptor in bone marrow-derived cells is detrimental in the evolution of renal fibrosis [J]. J Clin Invest，2002，110（12）：1859-1868.
[7] Zhang JD，Patel MB，Griffiths R，et al. Type 1 angiotensin receptors on macrophages ameliorate IL-1 receptor-mediated kidney fibrosis [J]. J Clin Invest，2014，124（5）：2198-2203.
[8] Weigert C，Brodbeck K，Klopfer K，et al. Angiotensin Ⅱ induces human TGF-beta 1 promoter activation：similarity to hyperglycaemia [J]. Diabetologia，2002，45（6）：890-898.
[9] Naito T，Masaki T，Nikolic-Paterson DJ，et al. Angiotensin Ⅱ induces thrombospondin-1 production in human mesangial cells via p38 MAPK and JNK：a mechanism for activation of latent TGF-beta1 [J]. Am J Physiol Renal Physiol，2004，286（2）：F278-287.
[10] Iwano M，Plieth D，Danoff TM，et al. Evidence that fibroblasts derive from epithelium during tissue fibrosis [J]. J Clin Invest，2002，110（3）：341-350.
[11] Fan JM，Ng YY，Hill PA，et al. Transforming growth factor-beta regulates tubular epithelial-myofibroblast transdifferentiation in vitro [J]. Kidney Int，1999，56（4）：1455-1467.
[12] Rodríguez-Vita J，Sánchez-López E，Esteban V，et al. Angiotensin Ⅱ activates the Smad pathway in vascular smooth muscle cells by a transforming growth factor-beta-independent mechanism [J]. Circulation，2005，111（19）：2509-2517.
[13] Yang F，Huang XR，Chung AC，et al. Essential role for Smad3 in angiotensin Ⅱ-induced tubular epithelial-mesenchymal transition [J]. J Pathol，2010，221（4）：390-401.
[14] Carvajal G，Rodríguez-Vita J，Rodrigues-Díez R，et al. Angiotensin Ⅱ activates the Smad pathway during epithelial mesenchymal transdifferentiation [J]. Kidney Int，2008，74（5）：585-595.
[15] Liu BC，Sun J，Chen Q，et al. Role of connective tissue growth factor in mediating hypertrophy of human proximal tubular cells induced by angiotensin Ⅱ [J]. Am J Nephrol， 2003，23（6）：429-437.
[16] Chen L，Liu BC，Zhang XL，et al. Influence of connective tissue growth factor antisense oligonucleotide on angiotensin Ⅱ-induced epithelial mesenchymal transition in HK2 cells [J]. Acta Pharmacol Sin，2006，27（8）：1029-1036.
[17] Sánchez-López E，Rodriguez-Vita J，Cartier C，et al. Inhibitory effect of interleukin-1beta on angiotensin Ⅱ-induced connective tissue growth factor and type IV collagen production in cultured mesangial cells [J]. Am J Physiol Renal Physiol，2008，294（1）：F149-160.
[18] Grimminger F，Schermuly RT，Ghofrani HA. Targeting non-malignant disorders with tyrosine kinase inhibitors [J]. Nat Rev Drug Discov，2010，9（12）：956-970.
[19] Chen J，Chen JK，Neilson EG，et al. Role of EGF receptor activation in angiotensin Ⅱ-induced renal epithelial cell hypertrophy [J]. J Am Soc Nephrol，2006，17（6）：1615-1623.
[20] Lautrette A，Li S，Alili R，et al. Angiotensin Ⅱ and EGF receptor cross-talk in chronic kidney diseases：a new therapeutic approach [J]. Nat Med，2005，11（8）：867-874.
[21] Qian Y，Peng K， Qiu C，et al. Novel Epidermal Growth Factor Receptor Inhibitor Attenuates Angiotensin Ⅱ-Induced Kidney Fibrosis [J]. J Pharmacol Exp Ther，2016，356（1）：32-42.
[22] Zhang Z，Yin D，Wang Z. Contribution of hypoxia-inducible factor-1α to transcriptional regulation of vascular endothelial growth factor in bovine developing luteal cells [J]. Anim Sci J，2011，82（2）：244-250.
[23] Sánchez-López E，López AF，Esteban V，et al. Angiotensin Ⅱ regulates vascular endothelial growth factor via hypoxia-inducible factor-1alpha induction and redox mechanisms in the kidney [J]. Antioxid Redox Signal，2005，7（9-10）：1275-1284.
[24] Tang L，Yi R，Yang B，et al. Valsartan inhibited HIF-1α pathway and attenuated renal interstitial fibrosis in streptozotocin-diabetic rats [J]. Diabetes Res Clin Pract，2012， 97（1）： 125-131.
[25] Xiong M，Jiang L，Zhou Y，et al. The miR-200 family regulates TGF-β1-induced renal tubular epithelial to mesenchymal transition through Smad pathway by targeting ZEB1 and ZEB2 expression [J]. Am J Physiol Renal Physiol，2012，302（3）：F369-379.
[26] Macconi D，Tomasoni S，Romagnani P，et al. MicroRNA-324-3p promotes renal fibrosis and is a target of ACE inhibition [J]. J Am Soc Nephrol，2012，23（9）：1496-1505.
[27] Di J，Jiang L，Zhou Y，et al. Ets-1 targeted by microrna-221 regulates angiotensin Ⅱ-induced renal fibroblast activation and fibrosis [J]. Cell Physiol Biochem，2014，34（4）：1063-1074.
[28] Pan J，Zhang J，Zhang X，et al. Role of microRNA-29b in angiotensin Ⅱ-induced epithelial-mesenchymal transition in renal tubular epithelial cells [J]. Int J Mol Med，2014，34（5）：1381-1387.
[29] Strutz F，Zeisberg M. Renal fibroblasts and myofibroblasts in chronic kidney disease [J]. J Am Soc Nephrol，2006，17（11）：2992-2998.