时间：2023-11-10 21:51:53
关键词 桑叶保健茶；生产；加工
中图分类号 TS272.5+5 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2013）18-0276-01
绩溪县位于北纬29°57′～30°20′，东经118°20′～118°55′，属亚热带湿润气候区，四季分明，光照适宜，年均气温15.99 ℃，年平均降水量1 500 mm。绩溪山连皖浙、水分南北，是黄山山脉与天目山山脉的结合带，长江水系与钱塘江水系的分水岭，新安江、青弋江、水阳江的源头。这里有山皆奇，无水不秀，人与自然和谐相处，森林覆盖率达75.5%，境内海拔千米以上山峰46座，其中大鄣山主峰清凉峰海拔1 787.4 m，为华东地区第二高峰，鄣山大峡谷中突兀巍峨的百丈岩、维妙维肖的伟人头像、徽杭古道上的江南第一关、佛教胜地小九华，以及古华阳十景等秀丽景色，历来为世人瞩目并歌咏诗赞。绩溪县生物资源极为丰富和多样，现有种子植物120科1 000余种，其中属国保植物30余种；陆栖脊椎动物135种，其中属国保动物13种。是联合国绿色产业示范县、部级生态示范区、国家生态县。
绩溪县是著名的蚕桑之乡，栽桑养蚕历史悠久。该县蚕业生产具有外向型特征，其经济效益既受气候、生产技术水平影响，又受市场行情左右，而且每一次茧价大幅下降，都会对绩溪县蚕业造成不可逆转的重创。随着农业产业结构的调整，现代农业、高效农业以及设施农业发展迅猛，如何提高蚕农蚕桑综合经济效益是亟待解决的问题。现阶段，变单纯依靠一颗茧、一根丝的单元经济为蚕桑多元化经济、抵御市场风险的理念近年来已被蚕业人员和蚕农所认识，实践证明，走生态、复合型经营的路子是蚕业稳定的有效途径。
1 开发桑叶保健茶的意义
随着农业结构的调整和退耕还林政策的实施，桑叶在满足养蚕所用之外，出现了过剩现象。而将桑叶开发用于饮料、保健食品等方面（如制成桑茶），可提高桑叶利用率。绩溪县是“国际绿色产业示范区”、“国家生态示范县”，笔者与省级茶叶专业合作社（上庄茶叶专业合作社）通过多年实践，利用“金山时雨”制作设备及工艺研究开发了瀚徽牌桑叶保健茶，既除去了原有桑叶的青涩味，又保留了桑叶原有的保健功效，且带有一股淡淡的清香，已成为大众所能接受、营养与保健作用兼具的上佳植物饮品。其工艺流程是：桑鲜叶—摊青—切叶—杀青—揉捻—初烘—整形—摊晾—高温短时间复烘—成品茶真空包装、冷藏。该茶的开发与应用，将对绩溪县稳定蚕桑产业和蚕农增收起到一定的促进作用。
2 桑叶保健茶的作用和功效
现代医学已鉴明：桑叶具有驱散风热、清肝明目等功能。桑叶已被我国卫生部列入“既是食品又是药品”的名单中，桑叶茶是最常见的产品。桑茶含有多种丰富的营养物质，如17种氨基酸、粗蛋白质、碳水化合物、醚浸出物、无机物及其他成分。桑茶对人体可起到强身保健功能，尤其在辐射条件下的工作者，长期饮用桑叶茶，有一定消除辐射的保健功能，并且不会产生因兴奋而失眠的副作用[1-2]。将桑叶茶汁煎代茗，能止消渴；煎浓汁服，能除脚气、水肿，利大小肠；嫩叶煎酒治一切风病，鸡桑煮汁熬膏服，可祛风及宿血，治劳热咳嗽，明目长发。
3 瀚徽牌桑叶保健茶的制作工艺
3.1 采叶
春季、晚秋时期，采摘黄山脚下胡适故里的上庄镇桑枝中上部无农药残留、无病虫害污染的嫩桑叶，弃去叶柄。根据桑叶老嫩程度，分别归档处理。在沙尘严重的地方，桑叶表面会附有尘土等，采前需用清水喷净晾干再采。春季，采摘顶芽成熟叶1～7片之间的叶子；秋季，选第2、3、4、5叶位的桑叶，也可利用养蚕多余的桑叶。
3.2 切叶、摊青标准
将采回的桑叶，进行老嫩归档，先切成1.5 cm×3.0 cm长宽的桑条，再按照摊放厚度10～15 cm、宽50 cm成一垄的规格，及时薄摊在洁净的竹匾或水泥平地上4～6 h，至桑叶自然萎软、光泽渐失转暗时付制，中间翻动1次，室内要求凉爽、洁净、通风。此时鲜叶含水量约70%[3]。
3.3 鲜叶堆放
主要工序是萎凋，即将桑叶薄摊在蚕匾或芦帘上，在室内搁放一定时间即可，若在室外摊放，则一定要在阴凉的地方进行，以使鲜叶失水[4]。经4～5 h萎凋，使可溶性蛋白、氨基酸含量增加，促进多量可溶性单、双糖的积累，利于桑茶滋味的形成，还可适当养活水分，使叶片柔软，韧性增强，便于造型。此外，还可消除青草味。
3.4 杀青
杀青，可去除青涩气。杀青务必要掌握好温度。在制茶过程中使用6CST-80D电热式滚筒杀青机杀青，杀青温度为280～300 ℃，转速不低于15.5 r/min，加工鲜叶150～200 kg/h，以桑叶边缘翻卷为适中。最终桑叶蒸发水分达到60%～64%，叶色由鲜绿色变为暗绿色，表面光泽消失，略有青香，手握叶质柔软，紧握成团，折而不断。
3.5 揉捻
揉捻一般可采用揉捻机揉捻加压，如6CR-55F方架揉捻机，掌握轻、重、轻的原则，注意嫩叶采用冷揉，即杀青叶摊晾至室温再揉；老叶中因含有较多的淀粉和糖，杀青叶不经摊晾趁热揉，有利于淀粉糊化，增加黏稠度，在热的作用下，纤维素软化，有利于成条；对中等嫩的桑叶，采用温揉，杀青叶稍经摊晾，叶片还有一定温度时揉捻，以兼顾外形和内质[5-6]。
3.6 初烘标准
采用110型滚筒机进行初烘，初烘时间10～15 min，使桑叶含水量达到6%～7%以下即可。要求桑叶受热均匀，缩小体型，固定外形，叶脉呈蟹青色，烘去桑叶的青草气味，激化并保留高沸点的芳香物质，获得颗粒桑叶茶特有的甘香，达到口尝咀嚼辨味适当，宜偏墨绿不偏生。
3.7 整形与烘干
采用50型双锅曲毫机进行整形，整形温度90 ℃，整形时间45 min，烘干温度标准80 ℃，时间30 min[7]。
3.8 分装标准
制成的桑绿茶，经过摊晾后再过筛，筛面为颗粒茶，筛底为片、末茶，需分开包装。用自动秤量，封口机真空封装，250、125 g均可。包装内袋用银色避光袋，外套用彩印商标筒（袋），至此即成颗粒桑绿茶成品[8-9]。
3.9 桑叶茶的保鲜
在桑叶茶制作包装以后置于1～2 ℃低温保鲜库贮藏保鲜待售[10]。
4 参考文献
[1] 李全，梁贵秋，陆飞，等.对桑绿茶加工技术的探讨[J].广西蚕业，2009（4）：51-53，63.
[2] 顾雪芳，张桂芳，朱兴淦，等.浅谈桑叶茶的开发和利用[J].上海农业科技，2010（1）：125-126.
[3] 杨玲英.桑叶茶的作用及生产加工技术[J].现代农业科技，2010（11）：348，350.
[4] 李克和，章道周，何卫中，等.桑叶茶的保健功能及其加工技术[J].现代农业科技，2007（21）：160.
[5] 周继荣，杨都.桑叶茶加工工艺初探[J].蚕桑茶叶通讯，2008，（2）：1-3.
[6] 林森.桑叶茶的加工技术[J].中国土特产，1998（3）：12.
[7] 范涛，鲍先巡，费明煦，等.桑叶红茶加工技术研究[J].北方蚕业，2005（3）：44-45.
[8] 蒋德俊，陈燕.桑茶精制技术[J].福建茶叶，2004（1）：32.
[9] 杨海霞，朱祥瑞，陆洪省.桑叶保健制品开发利用研究进展[J].科技通报，2003（1）：72-76.
第一、利用桑叶含有一种脱氧霉素。可阻止糖分解酶发挥作用。桑叶原物具有抑制血糖上升的功能，其主要功能成份是桑叶中的“生物碱”，这是一种具有特殊功能的成份，它是其它动、植物所没有的。
第二、平时多喝一些桑叶茶可以对我们的皮肤有很好的美容的功效，还可以有效的治疗脸部的痤疮、褐色斑。桑叶富含黄酮化合物、酚类、氨基酸、有机酸、胡萝卜素、维生素及多种人体必需的微量元素，这对改善和调节皮肤组织的新陈代谢，特别虽抑制色素沉着的发生和发展均有积极作用。
第三、桑叶茶可以减肥，就是与桑叶“消肿”、“清血”的作用有关。桑叶茶之所以能够消肿，是因为桑叶有利水的作用。利水作用与利尿作用不同，不光可以促进排尿，还可以使积在细胞中的多余水分排走。所以桑叶茶能够改善所谓的水肿现象。
（来源：文章屋网 ）
关键词 蚕桑产业；桑园；桑树；开发利用；陕西镇巴
中图分类号 S888.4 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2014）09-0284-01
蚕桑是镇巴县传统优势产业，由于生产历史悠久，自然条件优越，技术服务到位，蚕茧质量优异，有着良好的市场。但蚕桑产业也存在很多问题：一是生产经营未突破传统模式，主要依赖国际市场，加之科技投入不足，精深加工落后，特殊功用开发不到位，优势和功用得不到宣传，产品和桑园利用单一，抗风险能力差；二是近年受国际市场影响，蚕茧市场越来越萎缩，效益大幅度下降，蚕农收入受到严重影响；三是售茧收入未成为蚕农的主要经济来源，养蚕零星分散，专业化、集约化程度不高；四是农村劳动力资源紧缺，全县有农业人口25.4万人，其中劳动力约13.4万人，劳动力中约有6.2万人外出务工，留下的劳动力仅7万人左右。因此，针对以上问题，探讨镇巴县蚕桑资源如何走综合利用之路，以提高产业抗风险能力，确保优势蚕桑产业在脱贫致富奔小康中发挥积极作用。
桑树既是多年生叶用木本植物，又是落叶树种，采叶养蚕仅是利用了桑树的一部分，还有大量的桑枝、桑椹、桑叶等没有充分利用。同时，桑树每年冬季落叶后到春季新叶长出之前，有长达5个月的时间不能进行光合作用，并且在桑树生长季节，尤其是夏伐后，桑园光能损失也较大。因此，充分利用桑园光能和桑树副产品，能有效地提高栽桑的经济效益。
1 桑园的合理开发
1.1 桑园合理间作
一切农业技术措施的最终目的都是提高农作物的日光能利用率，达到提高产量和产值的目的。可以模拟自然界生物群落共生结构，创立各种资源分级利用，在桑园中进行合理间作，不失为提高土地和光能利用率、增加土地产出率、提高桑园综合效益的有效措施。
幼龄桑园第1～2年树冠矮小，枝叶稀少，可间作早熟黄豆、胡豆、绿豆或七星朝天椒等，镇巴县盐场镇新栽桑园间种七星朝天椒，收入可达6 750元/hm2以上。成年桑园利用桑树萌发、生长前期及收获后的稀叶期、落叶期间种萝卜、花菜、青白菜等，县蚕桑站2011年冬季在自有试验桑园间种萝卜3.33 hm2，产值达1 800元/hm2。利用桑树旺盛生长期形成的遮荫环境，栽培生姜、天麻、凤尾菇、草菇等喜阴作物。陕西省石泉县蚕桑站利用行间空地穴栽天麻，产值高达29元/m2 [1-2]。
1.2 桑园的立体利用
1.2.1 桑园养禽。桑园养禽具有除草、灭虫、增加有机肥等优点，技术简单易行。如养鸡300只/hm2，杂草较对照园区减少50%以上，全年排出鲜粪相当于纯N 225 kg/hm2、P2O5 195 kg/hm2、K2O 112.5 kg/hm2，是桑树全年需肥量的30%左右。桑园养禽既能增加蚕农收入，又能增加桑园肥力，可谓一举两得。
1.2.2 桑园梯坎栽植黄花菜。现实中桑园很大一部分为梯坎桑园，为了充分利用梯坎，防治水土流失，增加土地的利用率，提高经济效益，可采取在梯坎上种植黄花菜。
2 桑树的有效利用
2.1 桑枝与桑皮的利用
20世纪90年代中期，镇巴县就取得了桑枝生产食用菌的研究成果，并在生产上大面积推广应用。只要把好制种、消毒和接种关，利用桑枝木屑80%～90%，蚕粪和桑叶粉各5%～10%的混合料栽培香菇、黑木耳均能获得高产，其生物转化率达60%～120%。同时利用桑技木屑代替麦粒等原料制作食用菌原种，利用桑木屑代替马铃薯、萄葡糖、琼脂（蛋白胨）培养基制作食用菌母种获得成功。桑枝木屑袋栽食用菌以春、秋为好。镇巴县自然温度以3月中旬至5月中下旬，9月下旬至11月中旬为宜。外省利用桑枝栽培灵芝也获得成功。利用桑枝木屑栽培食用菌，不仅促进了食用菌的生产，而且提高了栽桑的经济效益[3-4]。
桑皮是造纸业的优质原料。按桑园获鲜桑枝22.5 t/hm2计，约可收获干桑皮3 375 kg/hm2，按0.6元/kg计算，可获产值2 025元/hm2。因此，在蚕桑生产集中的产区，只要理顺产销关系，出售桑皮可成为蚕农的副业之一，镇巴县宣纸厂即将恢复生产，技术成熟，桑皮利用已有成功经验。
2.2 桑果的利用
桑果又称桑椹，被国内外食品专家视为水果中的珍品。它含有人体所必须的各种营养成分，其中含水分80%左右，粗蛋白0.3%，糖分9%，有机酸1.5%左右，还含有果胶和一定量的维生素及无机盐类、紫红色素等，具有养血润燥、止渴生津、滋补健身的作用。50 kg鲜果可榨汁35 kg，经配料、过滤、装罐、脱气、杀菌、包装，可生产桑椹果汁、桑椹果酱、桑椹可乐等一系列桑椹保健饮料。新鲜桑椹还可直接生产桑椹罐头。陕西省汉阴县已有成功经验。
2.3 桑叶的利用
据《本草纲目》《中医学新编》等资料记载，桑叶是很好的中药。桑叶中含粗蛋白25%～42%、碳水化合物20%～25%及丰富的钾、钙成分和VA、VB、VC等，并有降血压、降血糖和消炎抗菌、延年益寿、抑制癌症的作用。冬桑叶可直接出售给药材公司作中药。用春叶或晚秋桑枝上部桑叶可制成桑叶茶供食用。
3 结语
总而言之，桑树全身都是宝，桑树副产品利用方式极其丰富，蚕桑立体经营前景广阔，在发展生产的同时，不失时机抓好副产物的综合利用，可提高蚕桑生产的综合效益。
4 参考文献
[1] 朱竟若，陶翔.桑茶的制作方法[J].江苏蚕业，1997（1）：62.
[2] 万继武.桑植保健饮料开发与生产技术[J].湖南蚕桑，1998（2）：38.
[3] 张万治.镇巴蚕桑产业发展调查分析[J].汉中科技，2011（2）：27-28.
材料与方法
1.实验材料
1）实验菌种：黑曲霉(AsPergillusniger)，GSICC60108，甘肃省微生物菌种保藏中心；日本根霉(RhizopusjaponicusVuillemin)，GIM3.119，广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心；绿色木霉(Trichodermaviride)，GIM3.443，广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心；青霉(Penicillium)，GSICC61603，甘肃省微生物菌种保藏中心。以上四种菌种的安全等级均高，其生物危害程度为四类，在通常情况下不会引起人类或者动物疾病。
2）实验样本：自然发酵桑叶茶、人工发酵桑叶茶由本实验室自制。
2.试剂与仪器
1）主要试剂：DNJ标准品，北京德威钠生物技术有限公司；甘氨酸（Gly），sigma公司；9-芴基氯甲酸甲酯（FMOC-Cl），sigma公司；乙腈为色谱纯，天津市四友精细化学品有限公司；没食子酸标准品，中国药品生物制品检定所；芦丁标准品，北京德威钠生物技术有限公司；其他常用试剂均为分析纯。
2）主要实验仪器：Waters1525HPLC，美国Waters公司；5810型台式高速离心机，德国Eppendorf公司；Spectrumlab22可见分光光度计，上海棱光技术有限公司；KQ5200DB型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。
3.实验方法
1）发酵桑叶茶的制备：采摘从顶芽往下数4-10片的新鲜桑叶，去柄，切为4cm×4cm的小叶片，混匀后称取100g叶片用微波杀青90s，揉捻，加入107cfu菌液10mL(自然发酵只加10mL无菌水)，复揉，28℃发酵5h，微波干燥，制得桑叶茶。（注：加菌量共为107cfu，菌种复配比例为1:1或1:1:1。）2）DNJ的测定测试样品的制备：取桑叶茶粉末0.5g，加入一定量超纯水，80℃水浴浸提2h(每20min摇匀一次)，抽滤后，滤渣再加水浸提2次。合并浸提液，用超纯水定容至50mL，即得样品提取液。DNJ的衍生化及测定方法按照参考文献[19]进行。色谱条件：色谱柱：C18柱（150mm×4.6×5μm）；流动相：乙腈-0.1%醋酸(50:50，V/V)；流速：1.0mL/min；柱温25℃；进样量10μL；紫外检测器，检测波长254nm。3）黄酮测定：取桑叶茶粉末0.5g于50mL离心管中，加70%乙醇15mL，80℃水浴80%功率超声提取15min，7000r/min离心5min，抽滤，得到滤液。如此共提取3次，滤液用70%的乙醇定容至50mL。吸取1.0mL滤液，用AlCl3比色法[20]测定4）多糖测定：取桑叶茶粉末0.250g于兰盖瓶中，加入20mL沸蒸馏水，在100%功率下55℃超声提取20min，将提取液过滤后定容至25mL。取1.0mL滤液用苯酚-硫酸法[21]测定多糖含量。5）多酚测定：按照GB/T8313-2008茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法[22]进行测定。
4.数据统计与分析：各实验至少重复3次以上，实验数据用Excel和Spss16进行统计处理。
结果和讨论
1.各活性成分标准曲线线性回归方程及相关系数
按照3.2）的实验方法，对不同浓度DNJ标准溶液进行测定，得到DNJ的标准曲线线性回归方程为y=15776x-70392，相关系数r=0.9996。式中x为DNJ浓度，μg/mL；y为峰面积。按照1.3.3实验方法，测定不同浓度芦丁标准溶液的吸光度，得到芦丁标准曲线线性回归方程为y=11.622x-0.0031，相关系数r=0.9997。式中，x为芦丁浓度，μg/mL；y为吸光度。按照1.3.4的实验方法，测定不同浓度葡萄糖标准溶液的吸光度，得到葡萄糖的标准曲线线性回归方程为y=10.909x-0.0021，相关系数r=0.9998。式中，x为葡糖糖的浓度，μg/mL；y为吸光度。按照1.3.5的实验方法，测定不同浓度没食子酸标准溶液的吸光度，得到没食子酸的标准曲线线性回归方程为y=0.0208x+0.0034，相关系数r=0.9998。式中，x为没食子酸的浓度，μg/mL；y为吸光度。实验结果表明，各标准曲线的相关系数均大于0.9990，线性关系良好，可用于样品中相关活性成分的测定。
2.DNJ标准品和样品的色谱图
将DNJ经衍生化后上高效液相色谱仪进行测定，得到如图1、图2、图3所示色谱图：由色谱图2可知，在本实验条件下，DNJ衍生物DNJ-FMOC的保留时间为2.731min，与Gly-FMOC和FMOC-OH的峰间距分别相差2.719min和4.243min，表明这两种物质均不干扰DNJ的测定。
3.单一菌种发酵桑叶茶中DNJ等活性成分含量变化
分别以黑曲霉、日本根霉、绿色木霉和青霉的单一接种于桑叶中进行发酵生产桑叶茶，与自然发酵生产的桑叶茶比较其DNJ等活性成分含量的变化。实验结果如表1：从表1可知，用绿色木霉发酵所得桑叶茶中DNJ含量为111.28mg/100g.干重，与自然发酵得到的桑叶茶比较，下降了6.43%，且有显著性差异（P＜0.05）；而日本根酶、黑曲霉、靑霉发酵后得到的桑叶茶中DNJ含量均上升，特别是日本根酶发酵后DNJ含量为131.56mg/100g.干重，与自然发酵的桑叶茶比较增加10.63%，具有极显著差异（P＜0.01）。与自然发酵比较，4种单一菌种发酵桑叶茶中多糖含量均下降，其中黑曲霉、青霉、绿色木霉发酵的桑叶茶中多糖含量与自然发酵的比较分别下降了14.48%、8.84%、9.18%，均具有极显著性差异（P＜0.01）；而日本根霉发酵桑叶茶中多糖仅下降了2.67%，无显著性差异（P＞0.05）。与自然发酵比较，用日本根霉发酵桑叶茶中黄酮增加了5.78%，有极显著性差异（P＜0.01）；而黑曲霉、青霉、绿色木霉3种菌发酵桑叶茶中黄酮含量分别降低了23.77%、0.86%、14.73%，其中黑曲霉、绿色木霉发酵的桑叶茶中黄酮下降有极显著差异（P＜0.01）；而靑霉发酵后黄酮含量下降无显著性差异（P＞0.05）。与自然发酵比较，用日本根霉、黑曲霉、青霉、绿色木霉发酵桑叶茶中的多酚含量分别降低了9.00%、33.56%、11.74%、24.56%，其中日本根霉发酵桑叶茶中多酚含量下降相对较少，但也有显著性差异（P＜0.05），而黑曲霉、青霉、绿色木霉发酵的桑叶茶中多酚含量下降有极显著性差异（P＜0.01）。综合单一菌种发酵实验的结果可知，与自然发酵比较，采用日本根霉发酵后所得桑叶茶中DNJ、黄酮含量有极显著增加；而多糖、多酚含量虽然有所下降，但比实验的其他菌种发酵后桑叶茶中这两种成分的下降低很多。因此，从对发酵桑叶茶功能成分影响来看，单一菌种发酵以日本根酶较好。#p#分页标题#e#
4.菌种两两混合发酵桑叶茶对DNJ等功能成分含量的影响
分别将黑曲霉、日本根霉、绿色木霉和青霉两两混合接种于桑叶中进行发酵生产桑叶茶，与自然发酵生产的桑叶茶比较DNJ等功能成分含量的变化。实验结果如表2：从表2可知，用日本根酶+绿色木霉、青霉+绿色木霉、黑曲霉+绿色木霉、黑曲霉+青霉混合发酵的桑叶茶中DNJ含量与自然发酵比较均有一定增加，但无显著性差异（P＞0.05）；而经日本根酶+青霉、日本根酶+黑曲霉发酵的桑叶茶中DNJ含量与自然发酵比较有轻微降低，但无显著性差异（P＞0.05）。而由日本根酶、黑曲霉、靑霉单独发酵生产的桑叶茶中DNJ含量均上升，而将它们两两混合后发酵生产的桑叶茶中DNJ含量却无此变化。表明这些菌种两两混合发酵对桑叶茶DNJ增加并无协同作用，反而可能具有一定的拮抗作用。从表2可知，黑曲霉+绿色木霉发酵的桑叶茶中多糖含量与自然发酵相比增加了0.57%，日本根霉+黑曲霉发酵的下降了1.21%，但差异无显著性（P＞0.05）；日本根霉+绿色木霉、青霉+绿色木霉、日本根霉+青霉、黑曲霉+青霉发酵的桑叶茶多糖含量分别下降了8.93%、8.84%、8.46%、5.09%，有极显著性差异（P＜0.01）。而用4种菌单独发酵的桑叶茶中多糖含量仅日本根霉发酵的与自然发酵比较下降差异无显著性，而其他3种菌发酵的桑叶茶多糖含量下降均具有极显著性差异。表明这4种菌两两混合后发酵生产桑叶茶与单独接种一样，会导致其中多糖含量下降。由表2可知，经日本根霉+绿色木霉、黑曲霉+青霉发酵桑叶茶中黄酮含量与自然发酵比较分别下降7.51%和9.22%，有极显著性差异（P＜0.01）；青霉+绿色木霉、日本根霉+青霉、黑曲霉+绿色木霉、日本根霉+黑曲霉发酵后桑叶茶中黄酮含量与自然发酵比较分别增加了5.00%、3.11%、0.12%、2.41%，除青霉+绿色木霉发酵的增加有显著性差异（P＜0.05）外，其他发酵的差异不显著。而当用4种菌单独发酵的桑叶茶中，除日本根霉发酵的桑叶茶中黄酮明显增加外，其余3种菌发酵的桑叶茶中黄酮含量均下降。实验结果表明，这4种菌两两混合发酵对桑叶茶中黄酮含量有下降的作用。由表2可知，用青霉+绿色木霉、日本根霉+青霉发酵后的桑叶茶中多酚含量与自然发酵比较分别增加了6.87%、9.06%，均有显著性差异（P＜0.05）；日本根霉+绿色木霉、黑曲霉+绿色木霉、黑曲霉+青霉、日本根霉+黑曲霉发酵桑叶茶中多酚含量分别降低了9.08%、15.19%、15.57%、13.12%，均具有显著性差异（P＜0.05）。而用4种菌单独发酵的桑叶茶中多酚含量与自然发酵比较均降低，其中日本根霉发酵的下降相对较少。实验结果表明，如用青霉+绿色木霉、日本根霉+青霉两两混合发酵对桑叶茶中多酚含量的增加有一定的协同作用。
5.种菌种混合发酵桑叶茶对DNJ等功能成分含量变化
分别将黑曲霉、日本根霉、绿色木霉和青霉按1:1:1的比例混合接种于桑叶中进行发酵生产桑叶茶，与自然发酵生产的桑叶茶比较其中DNJ等功能成分含量的变化。实验结果如表3：将黑曲霉+绿色木霉+青霉、绿色木霉+日本根酶+青霉、黑曲霉+绿色木霉+日本根霉、黑曲霉+日本根酶+青霉分别命名为A、B、C、D。可知，经A、B、C,3种菌种混合发酵生产的桑叶茶中DNJ含量与自然发酵得到的桑叶茶比较，分别增加了4.41%、5.20%、8.10%，其中经C混合发酵得到的桑叶茶中DNJ与自然发酵的比较具有显著性差异（P＜0.05）；而D发酵得到的桑叶茶中DNJ含量与自然发酵的比较降低了5.79%，但无显著性差异（P＞0.05）。而当用日本根酶、黑曲霉、靑霉发酵生产的桑叶茶中DNJ含量均上升，而将它们三种菌混合发酵生产的桑叶茶中DNJ含量虽有增加，但不如单独接种日本根霉增加的多，进一步证明它们混合发酵对桑叶茶中DNJ增加的影响无协同效应，而是可能具有拮抗作用。
从表3可知，用黑A、B、C、D发酵的桑叶茶中多糖含量与自然发酵比较分别降低了7.16%、13.96%、10.99%、9.41%，差异具有极显著性（P＜0.01）或显著性（P＜0.05）。而用4种菌单独发酵的桑叶茶中多糖含量仅日本根霉发酵的与自然发酵比较下降差异无显著性，而其他3种菌发酵的桑叶茶多糖含量下降均具有极显著性差异。表明这4种菌三三混合后发酵生产桑叶茶与单独接种一样，会导致其中多糖含量下降，而且它们的这种降低作用可能具有协同性。经A、B、C、D发酵桑叶茶中黄酮含量与自然发酵比较分别下降了为2.34%、8.41%、16.86%、9.30%，除A外，差异均有极显著性（P＜0.01）。而当用4种菌单独发酵得到的桑叶茶中，日本根霉发酵的桑叶茶中黄酮明显增加，其余3种菌发酵的桑叶茶中黄酮含量均下降。表明，这4种菌三三混合发酵对桑叶茶中黄酮含量可能具有协同的下降作用。经A、B、C、D发酵后桑叶茶中多酚含量与自然发酵比较分别降低了13.31%、12.52%、23.92%、7.67%，均有极显著性差异（P＜0.01）。而用4种菌单独发酵的桑叶茶中多酚含量与自然发酵比较也是降低的，其中日本根霉发酵的下降相对较少。表明，用4种菌单独或三三混合发酵都将导致生产的桑叶茶中多酚含量下降。
结论
1.与自然发酵比较，单独接种这4种菌发酵生产桑叶茶中以接种日本根酶可使其中DNJ含量达到0.133g%，比自然发酵的增加10.63%；而将4种菌两两混合发酵而生产的桑叶茶中DNJ含量无影响；而将黑曲霉+绿色木霉+青霉、绿色木霉+日本根酶+青霉、黑曲霉+日本根酶+青霉3种菌种混合发酵生产的桑叶茶中DNJ含量比自然发酵的有一定增加，但增加得不如日本根霉发酵的多。
2.与自然发酵比较，单独接种4种菌发酵生产桑叶茶中，除接种日本根霉生产的桑叶茶多糖含量无明显变化外，其余3种菌均使发酵桑叶茶多糖含量下降；将4种菌两两混合接种发酵生产的桑叶茶中，只有黑曲霉+绿色木霉和日本根霉+黑曲霉发酵的桑叶茶中多糖含量未受到影响，其余的菌种两两混合发酵都使桑叶茶中多糖含量下降；而将4种菌三三混合发酵均可使生产的桑叶茶中多糖含量明显下降。
3.与自然发酵比较，单独接种4种菌发酵生产桑叶茶中，除用日本根霉发酵桑叶茶中黄酮增加了5.78%，靑霉发酵对其中黄酮含量无影响外，另2种菌均使发酵桑叶茶中黄酮含量降低；将4种菌两两混合发酵生产桑叶茶，除青霉+绿色木霉发酵的可使黄酮含量增加5.00%外，其余的对发酵桑叶茶中黄酮含量无影响或使其下降；将4种菌三三混合发酵生产桑叶茶，除黑曲霉+绿色木霉+青霉对其中黄酮含量无影响外，其余的均使桑叶茶中黄酮含量下降。#p#分页标题#e#
4.与自然发酵比较，单独接种4种菌发酵生产桑叶茶可使其中多酚含量下降，其中日本根霉发酵桑叶茶中多酚含量下降9.00%，相对相对较少；将4种菌两两混合发酵生产桑叶茶，除青霉+绿色木霉、日本根霉+青霉发酵后的桑叶茶中多酚含量增加，其中日本根霉+青霉发酵的增加9.06%，较多，其余的使发酵桑叶茶中多酚含量降低；将4种菌三三混合发酵生产的桑叶茶中多酚含量均明显下降。
通过对上述研究结果的分析发现，用日本根酶单独发酵得到的桑叶茶中DNJ与自然发酵比较增加了10.63%，多糖含量未受到影响，黄酮含量增加了5.78%，多酚含量下降了9.00%，但与其他菌发酵的比较下降是最少的；经黑曲霉发酵后黄酮、多糖、多酚含量均分别下降了23.77%、14.48%、33.56%，是下降最高的。DNJ是桑叶茶中最主要的功能性成分。因此，认为日本根霉是在所用的实验菌种中保证发酵桑叶茶功能性质最好的菌种。
我们在以后的研究工作中，在保证桑叶茶安全性的前提下，还将进一步筛选其他的微生物与日本根霉共同作用，期望能进一步提高DNJ等功能成分含量，使发酵桑叶茶成为人们喜爱的、有明显保健作用的饮品。（本文图、表略）
[关键词] 桑叶；绿原酸；质量控制；反相高效液相色谱法
[中图分类号] R286.0 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）02（a）-0017-03
桑叶为桑科植物桑（Morus alba L.）的叶，初露后采收，除去杂质，晒干，具有疏散风热，清肺润燥，清肝明目之功效。主要用于风热感冒，肺热燥咳，头昏头痛，目赤昏花[1]。现代药理研究表明桑叶具有降血糖、降血压、降血脂、抗炎、抗衰老、抗肿瘤等功效[2-4]。对桑叶的质量控制研究大部分围绕中桑叶中的活性成分芦丁来进行相应的含量测定[5-6]，也有的围绕黄酮类成分进行相应质量控制研究[7]。目前，国内外市场对桑叶的需求愈来愈大，且本课题组在前期指纹图谱研究中发现绿原酸也是桑叶中的主要活性成分之一[8]，因此为了进一步控制桑叶质量，本研究采用反相高效液相色谱法（reverse phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）对从全国收集的桑叶药材进行绿原酸含量测定研究，现报道如下。
1 仪器与试剂
1.1 仪器
KQ-100B型超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；BPZ11D型电子分析天平（Sartorius公司）；Waters2695-2996高效液相色谱系统，Empower工作站，含四元梯度泵、自动进样器（Waters 公司）。
1.2 试剂
甲醇（色谱纯，TEDIA公司），乙腈（色谱纯，TEDIA公司），水为哇哈哈纯净水，冰乙酸（色谱纯，北京化工厂）。
1.3 对照品及样品
对照品绿原酸购于中国药品生物制品检定所（供含量测定用，批号110753-200413），不同产地的桑叶药材，均由湖南中医药大学生药学教研室潘清平教授鉴定为桑科植物桑（Morus alba L.）的叶。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱为Kromasil-C18（4.6 mm×250 mm，5 ？滋m）；流速：1.0 ml/min；检测波长：325 nm；柱温：30℃；进样体积：10 μl；流动相：乙腈（A）-1.0%醋酸水（B）梯度洗脱，洗脱程序：020 min，9%A18%A。按照上述色谱条件，待测成分绿原酸分离很好，无干扰，得色谱图1。
2.2 供试品制备
取桑叶粉（80目）约1 g置50 ml三角瓶，精密称定，加甲醇20 ml，称重，超声30 min（功率250 W，频率40 kHz），取出，静置，放凉，补重，0.22 μm微孔滤膜滤过，RP-HPLC分析。
2.3 对照品制备
精密称取绿原酸对照品适量，用甲醇溶解，定容，得到浓度为0.3890 ？滋g/？滋l的对照品溶液。
2.4 标准曲线的绘制
分别精密吸取“2.3”项下的绿原酸对照品溶液1、3、5、8、10、15、20 ？滋l进样分析，记录按上述色谱条件测定的峰面积。以峰面积为纵坐标（Y），进样体积（？滋l）为横坐标（X），得绿原酸的线性回归方程分别为：Y=182 283X-131 274（r=0.9994，0.3890～7.771 ？滋g）。
2.5 精密度
取同一供试品溶液，按上述RP-HPLC分析条件，连续进样6次，计算绿原酸峰面积，结果表明，峰面积RSD值
2.6 重现性
一份固定粉末样品，平行制备6份供试品溶液，进行RP-HPLC分析，考察绿原酸峰面积，峰面积的RSD值
2.7 稳定性
制备药材供试品溶液后，在室温下放置不同时间，分别于0、1、2、4、8、12、24、48 h进行RP-HPLC分析，以绿原酸的峰面积计算，考察样品的稳定性，主要成分的峰面积在48 h内RSD值
2.8 回收率试验
取同一批已知含量的桑叶药材样品约0.5 g，精密称定，分别精密加入一定量绿原酸对照品溶液，按“2.2”项制成加样供试品溶液，按上述色谱条件测定含量，计算回收率（表1）。从表1中可知，样品的平均回收率为98.91%，RSD为0.84%，表明回收率符合要求。
表1 加样回收率试验结果（n=6）
2.9 含量测定
按照上述色谱条件，将不同产地的样品进行处理和进样，每一个相同产地及批号的样品测3份，采用外标两点法计算桑叶中绿原酸的平均含量（表2）。从表2中可知，不同产地的桑叶药材绿原酸含量均在0.25%以上，最高的可达0.90%，提示绿原酸确实为桑叶中的一个主要成分。
表2 桑叶药材来源及其绿原酸含量的测定结果（n=3）
3 讨论
本实验根据定量化合物为酚酸，在甲醇中有较好的溶解度，选择甲醇超声，处理容易、可控；且样品呈酸性，选择醋酸水溶液作为水相，水相中醋酸比例是通过单因素多水平试验确定最佳比例为1.0%。选择乙腈作为有机相来分析中药复方，柱压稳定且较低，有利于保护仪器和色谱柱。波长选择325 nm也是基于所测化合物在该波长处吸收最大，且杂质干扰较少。梯度选择均一梯度变化以保证样品具有更好的重复性。
含量测定结果表明，不同产地桑叶活性成分绿原酸含量相差较大，中部地区河南、湖南产地的桑叶绿原酸含量较高。与目前药典中收载的芦丁含量相比，桑叶中绿原酸的含量均大于芦丁，因此建议药典桑叶标准中增加绿原酸含量测定。
在此次含量测定中，发现桑叶样品还有其他几个明显的色谱峰，课题组下一步准备分离制备这些色谱峰，进行相应结构鉴定和富集，为下一步开展桑叶中主要成分含量测定及其活性测试奠定基础。
中药质量标准是一个系统工程[9]，本文仅对桑叶中绿原酸的含量进行了测定，只是其质量标准的一个部分。其中，影响桑叶中绿原酸含量的因素很多，如产地、初加工、采收季节等，因此，只能把绿原酸作为评价桑叶质量的指标之一，应该建立更为系统、全面、体现中药特点的桑叶质量标准。
[参考文献]
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：化学工业出版社，2010：279.
[2] 罗存敏.桑叶提取物对小鼠血糖的影响及其有效成份测定[J].蚕业科学，2005，31（4）：418-421.
[3] 陈建国，步文磊.桑叶多糖降糖作用及其机制研究[J].中草药，2011，42（3）：515-520.
[4] 李超，潘建明，罗新根，等.桑叶消渴胶囊对2型糖尿病大鼠的影响[J].海南医学，2012，23（2）：18-20.
[5] 雷霖，何健飞.高效液相色谱法测定桑叶中芦丁的含量[J].中国卫生检验杂志，2012，22（3）：468-469.
[6] 周美环，赵书楷，陈淼，等.HPLC法测定桑叶中芦丁的含量[J].辽宁中医药大学学报，2010，12（5）：228-229.
[7] 马合木提·买买提明，美丽班·霍加.HPCE法测新疆桑叶中黄酮类成分的研究[J].食品研究与开发，2012，33（6）：134-136.
[8] 姚江雄，李春，廖端芳，等.桑叶药材HPLC指纹图谱研究[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（10）：119-121.
[9] 李贻奎，李连达.从复方丹参制剂的混乱看中药标准化的迫切性与必要性[J].中国中药杂志，2008，33（4）：349-354.
[关键词] 桑叶；肿瘤血管；内皮细胞；增殖；迁移；管腔形成
[中图分类号] R282.71 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）09（a）-0022-04
[Abstract] Objective To study the influence of mulberry on vascular endothelial cell proliferation and migration as well as lumen forming in tumor angiogenesis. Methods The change of HUVEC-2C cell quantity was measured with CCK-8 kit； HUVEC-2C cell migration was studied in Transwell chamber； HUVEC-2C cells were cultured in a 24-pore plate coated with Matrigel to observe its lumen forming. The experiment consisted of experiment group and control group， with three complex holes set for each group. Mulberry leachate was added to the experiment group. The effect of mulberry leaf to tumor angiogenesis was observed. Results Mulberry leachate could inhibit the proliferation ability of HUVEC-2C cell， with the inhibiting effect strengthened as the concentration increases. When the concentration was 100， 50， 25 mg/mL， the difference between the experiment group and the control group had statistical significance （P < 0.05）. When the concentration was 100 mg/mL， the cell proliferation inhibiting ratio of mulberry leachate could reach 37.6%. Observation on Transwell chamber showed the follows： added with mulberry leachate， the HUVEC-2C cells′migration ability was inhibited to some extent compared with the control group. In Matrigel experiment， compared with the comparatively complete cyclic structure formed by HUVEC-2C cells without mulberry leachate， the HUVEC-2C cells added with mulberry leachate were obviously inhibited in term of lumen forming. Conclusion Mulberry leachate has inhibiting effect on tumor angiogenesis by inhibiting vascular endothelial cell proliferation and migration as well as lumen forming.
[Key words] Mulberry leaf； Tumor angiogenesis； Endothelial cells； Proliferation； Migration； Lumen formation
1971年，Folkman[1]首次提出血管生成与肿瘤生长之间的关系问题。随后许多研究陆续证明，肿瘤形成初期，肿瘤细胞能够通过弥散方式获取营养物质。但长到一定大小后，必须从最近的血管处诱导形成自身血管。如果没有血管生成这一过程，肿瘤就会因得不到足够的营养和氧气而进入休眠阶段，甚至坏死[1]。血管为肿瘤生长提供营养和氧气，也是其排泄的通道，更是转移的必要条件[2]。这就为治疗肿瘤提供了一个新思路――通过阻断肿瘤血管的生长，切断肿瘤营养与氧气的供应，从而抑制肿瘤的发生和发展。肿瘤血管与正常血管存在很大差异，但无论是肿瘤血管还是正常的血管，血管内皮细胞（endothelial cell）都是血管的主要组成部分，衬贴于血管内壁。
目前，市场上销售的血管生成抑制药物大都成本高昂，作用途径比较单一，治疗不够彻底，副作用仍然较大，在实际应用中存在一些问题。近年来，随着人民生活水平的提高，饮食结构发生了显著变化，世界各地相关学者专家都在极力寻求天然、安全、保健性食品药品的开发，这种回归自然的愿望已成为走向21世纪的趋势。探寻引起不良反应小的植物成分药已成为血管生成抑制剂发展的重要方向[3]。特别是低价易得植物材料，不但可以解决恶性肿瘤早期防治问题，同时也可充分降低治疗成本，给更多癌症患者提供更大的生存机会。
桑叶，作为古老的中药，其味甘、性平、寒，具有清肝明目聪耳，镇静神经，润肺热，止咳的作用。近年来，有关学者致力于对天然、安全、保健性药食品的开发，通过对桑叶化学成分及生理功能的研究，发现其含有的黄酮类、生物碱等生物活性成分，具有降血糖、降血压、降血脂、抗炎、抗衰老等功效，还能预防肿瘤细胞的生成[4-8]，被国家卫生和计划生育委员会列为药食两用植物。特别是类黄酮中的槲皮素能够抑制多种肿瘤细胞的分裂增殖，通过多种途径促进其凋亡，抑制肿瘤细胞迁移及侵袭，降低其耐药性等作用[9-13]。笔者从血管生成抑制方面来研究桑叶中有效成分对肿瘤生长的影响。
本课题通过探讨低价易得植物材料桑叶中的有效成分对肿瘤血管内皮细胞增殖、迁移以及管腔形成的作用，来探索其对肿瘤血管生成的抑制作用，判断桑叶有效成分抑制肿瘤血管生成的可行性，从而为肿瘤早期预防和治疗提供新的方法。
1 材料与方法
1.1 实验材料
桑叶（日本株式会社黑姬和汉药研究所）；HUVEC-2C（Cascade biologics公司，批号C-003-2C）；PBS（pH为7.4，实验室配制）；DMEM高糖培养基（Biowest公司提供）；细胞消化液（Trypsin 0.25%-EDTA 0.02%，Biowest公司提供）；胎牛血清（South America Origin，Biowest公司提供）；双抗（青霉素-链霉素，碧云天生物研究所提供）；CCK-8（上海博谷公司）；Matrigel（威格拉斯生物公司提供）。
1.2 实验设备
超净工作台（SW-CJ-1B，苏州安泰）；电子天平（FA2104，上海舜宇恒平）；二氧化碳培养箱（CP-ST100A，长沙长锦科技）；超声处理仪（JY92-ⅡDN，宁波新芝生物科技股份有限公司）；旋转蒸发器（RE-52CS，上海雅荣生公司）；酶标仪（DNM-9602G北京普朗公司）；倒置生物显微镜（LWD200-37T，上海测维光电）等。镊子；手套；无菌针管；0.22 μm针头过滤器；2 mL PE试管；50 mL离心管；烧杯；量筒；双蒸水；培养皿；离心管；25 mL细胞培养瓶（Corning）；96孔细胞培养板（Corning）；3 mL巴氏吸管（Corning）；Transwell转移小室（Corning）；血球计数器。
1.3 方法
1.3.1 桑叶有效成分的提取[14-15] 精确称取桑叶粉3.00 g，浸泡于60 mL 75%的乙醇中。在50℃、20～25 kHz超声频率下超声30 min后过滤，并将滤渣用60 mL 75%的乙醇再次超声30 min。将得到的两次滤液合并超声混匀，再用0.45 μm的滤纸过滤。滤液用旋转蒸发器在0.08 mPa、60℃的环境下蒸发2.5 h以去除乙醇，得到的溶液定容至30 mL。之后使用0.22 μm的一次性针头过滤器过滤除菌，最终得到的桑叶液浓度为100 mg/mL，依次两倍梯度稀释至50、25、12.5 mg/mL。
1.3.2 细胞培养 实验中HUVEC-2C用配制好的DMEM高糖培养基（含10%胎牛血清，1%双抗）进行培养，用含0.25%胰蛋白酶（0.02% EDTA）消化传代。二氧化碳培养箱环境设置为5%CO2，37℃。
1.3.3 增殖实验 取对数生长期HUVEC-2C，进行消化、计数，控制细胞数量至5×104个/mL。在96孔板中设实验组（100、50、25、12.5 mg/mL）、阳性对照组、阴性对照组，每组设3个复孔，在实验组和阳性对照组中分别加入每孔100 μL的细胞悬液，阴性对照组加入100 μL培养基。在96板内培养HUVEC-2C 8 h直至细胞完全贴壁。在实验组中分别加入10 μL不同浓度桑叶制备液（100、50、25、12.5 mg/mL），阳性对照组、阴性对照组加入10 μL无血清的培养基。培养24 h之后将96孔板置于倒置显微镜下观察，发现细胞无异常生长情况，再在每孔中加入10 μL CCK-8检测试剂，1 h后用酶标仪在单波长450 nm处检测OD值。OD值与细胞密度成正比，OD值越大说明细胞密度越大，反之则越小。
1.3.4 迁移实验 取对数生长期HUVEC-2C，进行消化、重悬后计数，调整细胞数量至1×106/mL。在Transwell转移小室的上室每孔加入200 μL细胞悬液，下室加600 μL无血清DMEM培养基。细胞培养8 h后，在实验组的下室加100 μL浓度为100 mg/mL的桑叶浸出液，对照组加100 μL无血清DMEM培养基，每组设3个复孔。将Transwell转移小室置于5%CO2，37℃二氧化碳培养箱中培养8 h后，用PBS清洗小室内侧，棉球擦去上室内侧中的细胞。小室外侧细胞用无水酒精固定30 min，结晶紫染色30 min。洗净后置于倒置生物显微镜下观察、拍照并分析。
1.3.5 管腔形成实验 用每孔100 μL的Matrigel包被24孔板，室温下放置30 min使Matrigel凝固。取出对数生长期的HUVEC-2C，消化、重悬后计数，调整细胞数量至5×105/mL。实验组和对照组每孔接种500 μL细胞悬液。此外，对照组不加桑叶浸出液，实验组加50 μL浓度为100 mg/mL的桑叶浸出液，每组设置3个复孔。将24孔板放入5%CO2，37℃培养箱中培养，8 h后置于倒置生物显微镜下观察，随机选3个视野拍照。
1.4 统计学方法
采用统计软件SPSS 17.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。其中细胞增殖的抑制率（%）=1-实验组/对照组×100%。
2 结果
3 讨论
正常环境下，血管生成是一个高度有序的过程，只有生长组织有所需求时，才会诱导单层静态内皮细胞分化及血管网络伸展。而肿瘤细胞可以通过模拟正常血管生成过程形成自身血供。肿瘤血管生成主要是通过分泌促血管生长因子，诱导内皮细胞异常增殖、迁移和形成管腔[16]。
桑叶液具有抑制内皮细胞系增殖的能力，抑制作用随着浓度的增长而增强。通过观察Transwell小室，与对照组相比添加了桑叶液的内皮细胞系，其迁移能力受到一定的制约作用。Matrigel实验中，与未加入桑叶液的内皮细胞系所形成的较完整的环状结构相比，加入桑叶液的内皮细胞系在管腔形成方面受到明显的抑制作用。实验表明，桑叶液通过抑制血管内皮细胞增殖、迁移和管腔形成，对肿瘤血管的生成具有抑制作用，从而为其制约肿瘤血管生成、切断营养与氧气供给和废弃物排泄通道、促使肿瘤细胞凋亡提供有力佐证。本研究为桑叶在肿瘤早期预防和治疗中的应用提供了实验依据，使肿瘤早期防治和低成本治疗成为可能。
关于本研究只进行了大量的定性实验，得出桑叶具有抑制血管生成的功效，具体程度尚不明确，且桑叶中的有效组分未知，在之后的研究中将就以上两个方面进一步给予探讨。
[参考文献]
[1] Folkman J. Tumor angiogenesis： therapeutic implications [J]. The New England Journal of Medicine，1971，285（21）：1182-1186.
[2] Kerbel RS. Tumor angiogenesis：past， present and the near future [J]. Carconogenesis，2000，（21）：505.
[3] 徐韬，许瑞安.中药及其有效成分抗肿瘤作用机制研究进展[J].华侨大学学报，2009，30，（4）：359-365.
[4] 张举，肖更生，聊森泰，等.桑叶综合利用进展[J].广东蚕业，2003，4（1）：38-41.
[5] 王芳，励建荣.桑叶的化学成分、生理功能及应用研究进展[J].食品科学，2005，26（1）：111-116.
[6] 欧阳臻，陈钧.桑叶的化学成分及其药理作用研究进展[J].江苏大学学报：自然科学版，2003，24（6）：39-43.
[7] 何雪梅，廖森泰，刘吉平.桑叶的营养功能性成分及药理作用研究进展[J].蚕业科学，2004，30（4）：390-393.
[8] 张春丽.中药对肿瘤血管生成抑制作用的研究[J].北京中医药，2011，30（2）：156-160.
[9] Wachter J，Neureiter D，Alinger B，et al. Influence of five potential anticancer drugs on wnt pathway and cell survival in human biliary tract cancer cells [J]. Int J Bid Sci，2012，8（1）：15-29.
[10] Qin Y，He LY，Chen Y，et al. Quercetin affects leptin and its receptor in human gastric cancer MGC-803 cells and JAKSTAT pathway [J]. Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi，2012，28（1）：12-16.
[11] Senthilkumar K，Arunkumar R，Elumalai P，et al. Quercetin inhibits invasion，migration and signalling molecules involved in cell survival and proliferation of prostate cancer cell line （PC-3） [J]. Cell Biochem Funct，2011，29（2）：87-95.
[12] Borska S，Chmielewska M，Wysocka T，et al. In vitro effect of quercetin on human gastric carcinoma：Targeting cancer cells death and MDR [J]. Food Chem Toxicol，2012，50（9）：3375-3383.
[13] 苏维词.槲皮素的癌化学预防作用研究进展[J].中草药，2001，32（4）：380-381.
[14] 张军.桑叶有效成分提取与分析[D].合肥：安徽农业大学，2004.
[15] 陈丛瑾，黄克瀛，李德良，等.植物中黄酮类化合物的提取方法研究概况[J].生物质化学工程，2007，41（3）：42-46.
[16] 马嵋，张燕，张玲，等.人胃癌细胞株裸鼠皮下移植瘤模型的建立及其生物学特性[J].中国实验动物学报，2012，20（6）：57-60.
[关键词] 桑叶；指纹图谱；超高效液相色谱法
[中图分类号] R286[文献标识码] A[文章编号] 1674-4721（2014）05（b）-0008-04
Study on UPLC fingerprint of Morus alba L. from different regions
PENG Li-ying PENG You-ling YANG Xian-guo
Hunan Traditional Chinese Medical College,Zhuzhou412012,China
[Abstract] Objective To establish UPLC fingerprint of Morus alba L. from different regions. Methods Column ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50.0 mm,1.7 μm)was used.The mobile phase was methanol-0.2％ phosphoric acid water with gradient elution.The detection wave-lengths was 358 nm and column temperature was 40℃ with the flow rate of 0.6 ml/min.The sample injection was 1 μl. Results A specificity fingerprint chromatogram was produced and 15 characteristic peaks were designated.The results showed that the collected samples had a good similarity. Conclusion UPLC fingerprint is a reliable,available and quick method of quality control of Morus alba L. and it is necessary for the safe and practicable use of the medicine.
[Key words] Morus alba L.;Fingerprint;UPLC
桑叶为桑科植物桑（Morus alba L.）的叶，初露后采收，除去杂质，晒干，具有疏散风热、清肺润燥、清肝明目的功效，主要用于风热感冒、肺热燥咳、头晕头痛、目赤昏花[1]。桑叶药食两用，现代研究表明桑叶具有降血糖[2-4]、降血压[5]、降血脂、抗炎、抗衰老[6]、抗肿瘤[7]等功效，在药用和食品保健方面都发挥了重要作用。目前，桑叶的质量控制主要集中于芦丁和绿原酸含量的测定[8-12]，除芦丁外，其他黄酮类化合物也是桑叶质量控制的热点[13-16]。随着国内外市场对桑叶的需求愈来愈大，桑叶的质量也参差不齐。课题组认为中药是多成分、多环节、多靶点的药物，质量控制也需要体现中药特色，仅靠单一或几个指标难以衡量质量的优劣。中药指纹图谱是一种综合的、可量化的鉴定手段，是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性，符合中医中药整体性和模糊性的特点[17]。课题组为了进一步控制桑叶质量，采用UPLC方法，对从全国收集的桑叶药材进行指纹图谱进行研究。
1 仪器与试剂
1.1 仪器
KQ-100B型超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；JA51002型电子分析天平（岛津）；Waters Acquity UPLC H-Class超高效液相色谱系统，Empower工作站，含四元梯度泵、自动进样器、紫外检测器（Waters公司）。
1.2 试剂
甲醇（色谱纯，TEDIA公司），乙腈（色谱纯，TEDIA公司），水为娃哈哈纯净水，磷酸（色谱纯，北京化工厂）。
1.3 对照品及药材
对照品异槲皮苷和紫云英苷，购于成都植标化纯生物技术有限公司，供含量测定用，批号分别为PCS0371-lot 120510和PCS0468-lot 120328；对照品芦丁购于中国食品药品检定研究院，批号为0080-9705。不同产地的桑叶药材11批，均由湖南中医药大学生药学教研室潘清平教授鉴定为桑科植物桑（Morus alba L.）的叶，药材批号及来源见表1。
表1 桑叶药材批号及来源
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50.0 mm，1.7 μm）；流速：0.6 ml/min；检测波长：358 nm；柱温：40℃；进样体积：1 μl；流动相：甲醇（A）-0.2%磷酸水（B）梯度洗脱，洗脱程序：022 min，10%A32%A。
2.2 供试品溶液的制备
药材粉碎，过60目筛，取药粉约0.5 g，精密称定，置于100 ml三角瓶中，加入75%甲醇50 ml，超声处理（功率250 W，频率33 kHz）30 min，放冷，用75%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。
2.3 对照品溶液的制备
精密称取对照品异槲皮苷、芦丁和紫云英苷适量，用75%甲醇溶解，定容，得到其浓度分别为0.092、0.042、0.054 μg/μl。
2.4 方法学考察
2.4.1 精密度试验取同一批桑叶供试品（20080305），按照2.2项的方法制备供试品溶液1份，按照上述色谱条件，连续进样6次，测定指纹图谱。以10号峰（图1）的保留时间和峰面积为参照，计算样品中所含15个共有峰的相对保留时间和相对峰面积。各共有峰的相对保留时间的RSD＜0.5％，相对峰面积的RSD＜1.0％，表明仪器的精密度良好。
图1 桑叶药材共有模式指纹图谱
2.4.2 重复性试验按上述方法平行制备同一批桑叶供试品（20080305），测定指纹图谱。考察样品中所含有15个共有峰的相对保留时间和相对峰面积，各色谱峰的相对保留时间的RSD＜0.5%，相对峰面积的RSD＜1.0％，提示方法的重复性良好。
2.4.3 稳定性试验同一批桑叶供试品（20080305）溶液，分别于0、2、4、6、8、12、24 h进样测定，以各峰的相对保留时间和相对峰面积进行考察，桑叶样品24 h各色谱峰的相对保留时间的RSD＜0.5％，相对峰面积的RSD＜1.0％，表明桑叶样品溶液在24 h内稳定性良好。
2.5 指纹图谱的建立
2.5.1 指纹图谱共有模式的建立取桑叶药材样品11批，按照2.2下方法制备供试品溶液，分别进样1 μl，记录UPLC色谱图。采用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2.0版）进行分析，生成共有模式指纹图谱，有15个共有峰（图1），其中以峰10（S峰）为参照物，其余各共有峰与峰10的相对保留时间与相对保留面积见表2。
2.5.2 共有峰的确定11批桑叶药材样品导入软件，得共有指纹图谱（图2），对照品溶液的色谱图见图3，经与对照品对照，指认10、11、12号峰分别为异槲皮苷、芦丁、紫云英苷。
2.5.3 指纹图谱的相似度评价上述11批桑叶样品相似度计算结果依次为0.970、0.968、0.967、0.896、0.941、0.983、0.983、0.918、0.964、0.994、0.989、0.989，以上数据表明桑叶各批次相似性较好。
3 讨论
本次实验选用UPLC开展桑叶指纹图谱研究，与HPLC相比，UPLC方法快速简便、稳定可靠。本次桑叶指纹图谱实验分析时间在22 min内，更加快捷和节约溶剂。
本实验根据桑叶中主要成分为黄酮类、酚酸类化合物，在75%甲醇中有相对较好的溶解度，选择75%甲醇超声，样品前处理简单、可控；样品呈弱酸性，选择极低浓度的磷酸水溶液作为水相；选择甲醇作为有机相来分析中药桑叶，与乙腈相比更加安全和便宜；波长选择358 nm也是基于主要化合物在该波长处吸收相对最大，且杂质干扰较少；梯度选择均一梯度变化以保证样品具有更好的重复性。
相似度结果表明，不同批次桑叶样品相似度计算结果均＞0.85，表明所收集的桑叶药材质量相对均一稳定，当然也与药用桑叶样品只有一种来源有关。
[参考文献]
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典一部[M].北京：化学工业出版社，2010：279.
[2]李超，潘建明，罗新根，等.桑叶消渴胶囊对2型糖尿病大鼠的影响[J].海南医学，2012，23（2）：18-20.
[3]陈建国，步文磊.桑叶多糖降糖作用及其机制研究[J].中草药，2011，42（3）：515-520.
[4]罗存敏.桑叶提取物对小鼠血糖的影响及其有效成份测定[J].蚕业科学，2005，31（4）：418-421.
[5]阎百传.霜桑叶稳定了我的血压[J].长寿，2008，（12）：43.
[6]王灿，左艇，王琳琳.桑叶黄酮抗皮肤衰老实验研究[J].中国医药导报，2011，8（3）：30-32.
[7]杨燕，王洪庆，陈若芸.桑叶中的黄酮类化合物[J].药学学报，2010，（1）：77-81.
[8]周美环，赵书楷，陈淼，等.HPLC法测定桑叶中芦丁的含量[J].辽宁中医药大学学报，2010，12（5）：228-229.
[9]雷霖，何健飞.高效液相色谱法测定桑叶中芦丁的含量[J].中国卫生检验杂志，2012，22（3）：468-469.
[10]郭红霞，谢文剑，曹艺，等.RP-HPLC测定桑叶中绿原酸的含量[J].中国当代医药，2014，21（4）：17-19.
[11]徐韧柳，李丽华，康怀萍.RP-HPLC测定桑叶中绿原酸的含量[J].中国中医药信息杂志，2005，12（1）：53-54.
[12]孙莲，张丽静，孟磊，等.RP-HPLC法测定桑叶中绿原酸的含量[J].中草药，2003，34（1）：78-79.
[13]严安定，袁野，吴亮，等.HPLC法同时测定桑叶中芦丁、异槲皮苷、紫云英苷的含量[J].安徽医药，2011，15（3）：296-298.
[14]吴羽艳.桑叶中总黄酮的含量测定方法研究[J].轻工科技，2013，（4）：43-44.
[15]张亮亮，汪咏梅，徐曼，等.不同品种桑叶多酚和黄酮含量变化规律研究[J].时珍国医国药，2013，24（5）：1064-1066.
[16]张强，孙长波，张晶.桑叶中多糖和总黄酮的含量测定[J].吉林农业・学术版，2011，（3）：73-74.
[17]李强，杜思邈，张忠亮，等.中药指纹图谱技术进展及未来发展方向展望[J].中草药，2013，44（22）：3095-3104.
（收稿日期：2014-04-08本文编辑：李亚聪）
[作者简介] 彭丽英（1977-），女，湖南怀化人，本科，主管中药师，主要从事中药鉴定与中药调剂、中药质量标准的教学与科研工作
我喝茶，对茶叶没什么挑剔，我认为真正善饮之人对茶叶的选择，没有贵贱之分。所以我喝的大都是便宜的花茶和绿茶。除这两者之外，近年来也开始自己制作一些茶来喝。
前年清明前，单位到郊外春游，在采蕨菜之际，我发现了一片荒弃的茶园，春阳下嫩绿的新芽朝天竖着，散发着淡淡的清香，就欣喜地采摘起来。采茶其实是很辛苦的，手指都摘痛了，才采了不到一斤的茶叶。我怕把它挤坏了，还到池塘里摘了几片荷叶，细心地包成好几包。
回到家，我就兴致勃勃地做起茶来。我先把茶叶洗净，晾干水分，然后将铁锅用微火烧热，放进茶叶，不停地用双手翻动。等茶叶变色变软了，就边翻动边用双手搓，渐渐地茶叶在我手里渗出了一些绿汁，变形成团，成条了。这时我熄了火，把茶叶摊在盘里，等不得它慢慢晾干，就放进微波炉里，用小火烘了十分钟，碧绿清香的茶就制成了。我马上沏一杯，只觉清香扑鼻，茶味醇厚悠长，竟比市场上买的茶还好喝。欣喜之际，我对几张硕大的荷叶也不想放弃了。我知道荷叶可以熬汤喝，并且具有降低血压，减肥健美之功效。但如何制作成茶呢?踌躇之际，想起陆羽的《茶经》中曾经说过：“晴采之，蒸之，捣之，拍之，焙之，穿之，封之，茶之干矣。”我制茶是按现代茶农的方法在制，古人却并不是用炒锅杀青，而是蒸。于是等锅里水烧开后，我将荷叶入锅蒸了约5分钟，待荷叶变色变软了，取出，晾干水气，切成长约一寸的粗丝，下铁锅边炒边用力搓、捏、揉，由于已经蒸软，虽费力，但却搓成团了，同样也是放进微波炉里烘干。制成的荷叶茶碧绿清香，闻着都醉人，我连忙沏了一杯，茶成淡绿色，幽幽的散发着香气，啜一口，微涩中荷香淡远，甘甜清冽，喜得我陡生出“天生我才必有用”的喜悦。
因为荷叶农人一般不让采，不易得之，这茶就成了我的珍品了，轻易舍不得喝，即使喝，也是放一点在茶叶里，在茶香中品尝荷叶的清香。荷叶茶珍贵，其中却隐含着一丝遗憾，但这种遗憾在今年四月底，就被新的喜悦替代了。
那是一个周末，朋友约我去照母山采桑葚。那是规划中的公园，农人都搬迁了，但山上有大片的桑树。我们去晚了，好的桑葚都被人采光了，只剩下一些未成熟的青桑葚。失望的我望着嫩绿的桑叶，突然心一动，桑叶具有疏散风热、清肝明目之功效。古人说，服了令人耳聪目明、轻身，肌肤润泽，精力旺盛，不易衰老。明朝张岱《夜航船》记载：“桑木者，箕星之精神也。蚕食之成文长，人食之老翁为小童。”既然荷叶能制茶，桑叶不一样可以制茶吗?我就摘了一大包，兴冲冲地回家了。
我将桑叶洗净，嫌蒸麻烦，心想即能蒸之，也能焯之，目的是杀青去涩味。就烧一大锅水，待水沸后，也不等桑叶晾干，就将桑叶分批下到沸水里，煮至桑叶变软变色，捞起，摊晾干后，同样切成小条，用微火将铁锅烧热后，下桑叶条边烘烤边用手揉、搓、捏。渐渐地桑叶开始卷曲成团状，就将它们装进盘里，同样放进微波炉烘烤。因为是沸水焯的，水分较重，烘烤了近二十分钟，墨绿清香的桑叶茶才制成。我怀着忐忑的心放一些在玻璃杯里，沸水注入后，见桑叶茶开始散开，绿幽幽的汁液悠悠弥漫开来，不一会儿满杯都是青色的茶水了，小心地啜一口，桑叶的清香就在唇舌间弥散开来，还带着丝丝甘甜味儿。
成功了!欣喜的我觉得应该让更多的人分享我的成功。于是我就送了一些给朋友，他们品尝后竟然都说不错。特别是一个朋友喝了后大加赞赏，说才喝两天就将口臭病治好了，还向我要。因为桑叶不比荷叶，来源广，也易采到，我也大方地又给了他一些。不想到了六月，桑叶茶竟已告罄。于是我又去采了一些回来，在采时我就感觉到，桑叶老了，变粗糙了，果然，制作时或蒸或焯，都不能使之变柔软，搓揉时费很大的力，也难以成团了，制成后的味道与之前相比，也差远了。始知茶圣陆羽没有说错：“凡采茶，在二月三月四月之间。”