真核细胞范文

真核细胞篇1

单克隆抗体技术自1975年问世以来，在生命科学研究及临床疾病检验、治疗等方面的应用日益广泛，然而单克隆抗体多来源于小鼠，使其在体内的应用受到一定限制，因此需对单克隆抗体进行人源化改造。欧美正式批准上市，以及正在临床试用的治疗性单抗中以人源化鼠单抗数量为多。在抗体的制备过程中，抗体的表达载体系统多采用二氢叶酸还原酶（dhfr）基因作为可扩增选择标志基因，同时在培养基中加入甲氨蝶呤（mtx）来得到高拷贝量的抗体表达[1]。但是，mtx具有细胞毒性，会抑制细胞生长、引起细胞形态改变[2]。为了避免抗生素筛选药物对细胞的影响，各国学者做了大量研究。日本学者m.kawahara等人在2003年成功构建了抗原介导的遗传修饰细胞扩增体系（antigenmediated genetically modified cell amplification,amega），将抗体的vl、vh与epor d2功能区和gp130跨膜功能区嵌合表达于细胞膜上，在细胞培养基中加入抗原，通过抗原与抗体的结合，有效地激发细胞因子胞内生长信号的传导，从而大量扩增细胞[3]。本研究借鉴这一细胞扩增体系构建细胞因子受体抗人afp人鼠嵌合抗体基因，探索获得高表达全抗体的新方法。

    1材料与方法

    1.1材料

    1.1.1菌株、质粒大肠杆菌菌株e. coli dh5α由本室保存。pgemteasy载体购自美国promega公司。载体pag4622、pah4604均由海军总医院王琰教授惠赠。质粒pvitro2购自美国invivogen公司。抗人afp单链抗体表达载体pet32/scfv由本室构建。

    1.1.2实验标本标本来源于人胚胎肝脏组织，均取自非疾病死亡的引产胎儿，胎龄28周，胚胎的使用已得到医院和产妇的同意。

    1.1.3主要试剂trizol reagent购自美国gibco brl公司。one step rna pcr kit（amv）、ex taq、t4 dna ligase及各种限制酶均购自大连takara公司。胶回收纯化试剂盒、质粒抽提试剂盒均购自美国omega公司。寡核苷酸引物由上海英骏生物技术有限公司合成（表1）。表1  pcr引物的名称和序列

1. 2方法

    1. 2. 1  epor胞外区基因及gp130跨膜区基因的克隆和拼接trizol法提取4月孕流产胎儿肝脏总rna，用epf1/epr1引物对扩增epor胞外区基因，用gpf/gpr引物对扩增gp130跨膜区基因，rtpcr反应条件为50 ℃逆转录30 min，94 ℃预变性5 min，然后94 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃1 min，30个循环，最后72 ℃延伸10 min。胶回收纯化rtpcr反应产物epor1和gp130，并分别克隆到pgemt easy载体上，测序鉴定。用epf2/epr2引物对从epor1t载体上扩增epor胞外区基因，在其5′加入肠激酶（enterokinase）的碱基序列：gacgacgacgacaag，胶回收纯化pcr反应产物epor2，并克隆到pgemt easy载体上，测序鉴定。用hindⅲ和claⅰ双酶切gp130t载体中的gp130跨膜区基因，和相应酶切的epor2t载体连接，获得eeporgp130t载体。

    1. 2. 2人鼠嵌合抗体轻链载体的构建用vlf/vlr引物对从抗afp单链抗体表达载体pet32/scfv中扩增vl基因，用clf/clr引物对从含有人kappa轻链恒定区序列的载体pag4622中扩增cl基因[4]，分别克隆到pgemt easy载体上，测序鉴定。用bglⅱ和ecorⅰ双酶切vlt载体中的vl基因，和相应酶切的载体pvitro连接，获得pvitrovl载体。用ecorⅰ和xhoⅰ双酶切clt载体中的cl基因和相应酶切的载体pvitro连接，获得pvitrol载体。

    1. 2. 3人鼠嵌合抗体重链载体的构建用vhf1/vhr引物对从抗afp单链抗体表达载体pet32/scfv中扩增vh1基因，克隆到pgemt easy载体上，测序鉴定。用ecor v和nheⅰ双酶切vh1t载体中的vh基因，和相应酶切的含有人gamma1重链恒定区序列的载体pah4604连接[4]，获得vhpah4604载体。用vhf2/chr引物对从vhpah4604载体中扩增人鼠嵌合重链基因vhch，克隆到pgemteasy载体上，测序鉴定。

    1. 2. 4细胞因子受体抗人afp嵌合抗体表达载体的构建用bamhⅰ和kpnⅰ双酶切vhcht载体中的vhch基因，和相应酶切的eeporgp130t载体连接，获得heporgp130t载体。用bamhⅰ和claⅰ双酶切heporgp130t载体中的heporgp130基因，和相应酶切的pvitrol载体连接，获得pvitroegig载体（见图1）。

    2结果

    2. 1epor胞外区基因及gp130跨膜区基因的克隆

    trizol法从4月孕胎肝组织中提取总rna，琼脂糖凝胶电泳示：28s和18s条带清晰，且28s:18 s＞1。rtpcr扩增epor和gp130，epor胞外区基因750bp，gp130跨膜区基因900bp，与预计大小一致（见图2）。epor和gp130分别克隆到pgemt easy载体，测序结果经blast比对，与genebank中报导一致。

    2. 2细胞因子受体抗人afp嵌合抗体表达载体的构建

    重组载体pvitroegig经相应酶切后，分别获得epor胞外区，gp130跨膜区，及嵌合轻链和重链，人鼠嵌合轻链基因630bp，嵌合重链基因1929bp，与预计大小一致（见图3）。结果表明，细胞因子受体抗人afp人鼠嵌合抗体真核表达载体构建成功。

    3讨论

    甲胎蛋白（alphafetoprotein，afp）是原发性肝癌诊断和生物治疗的一种重要肿瘤相关靶抗原，抗afp单抗多用于肝癌的放射免疫显像和导向治疗。但是单抗为鼠源性，应用于人体时可在体内产生人抗小鼠抗体（hama），既影响单抗的治疗效果，又有可能诱发过敏反应；此外，鼠单抗在人体内的半寿期较短，不能有效激活人体的补体依赖的细胞毒（cdc）作用及抗体依赖的细胞毒（adcc）作用。因此，通过用人igg抗体恒定区取代鼠单抗恒定区进行人源化，可消除其大部分异源性，并能保留亲本鼠单抗结合抗原的特异性和亲和力。迄今已构建了很多人鼠嵌合抗体，通过大量的实验和应用证明嵌合抗体确实保留了亲本鼠单抗的抗原结合能力并能降低免疫原性[1]。由本室制备的抗人afp单链抗体具有较高的生物活性，竞争elisa实验显示：以单克隆抗体为阳性对照，抗afp单链抗体可抑制53%的单克隆抗体与抗原afp结合[5]。因此可以将其vl/vh链作为新的嵌合受体的识别单位，通过抗原afp与抗体vl/vh特异性结合，诱发eporgp130融合蛋白的聚合,从而激发细胞生长信号传导，筛选出能与抗原高亲和性结合的抗体表达细胞[3]。

    促红细胞生成素受体（erythropoietin receptor，epor）是ⅰ型细胞因子受体超家族成员。 gp130是白细胞介素6（il6）、白血病抑制因子（lif）、抑瘤素m（osm）、睫状神经营养因子（cntf）、白细胞介素11（il11）和心肌营养素1（ct1）所共用的受体和信号传导子[6]。虽然epor与gp130在结构和功能上不尽相同，但是二者之间有很多相似之处。epor与gp130均可结合并激活酪氨酸激酶（janus kinases，jaks），激活的jaks可活化信号转导与转录活化子（signal transducer and activators of transcriptions，stats），使其酪氨酸残基磷酸化，并结合成二聚体转位到胞核内，与特异的靶序列增强子结合调节基因转录[6,7]。也有文献报道gp130与epor分别可直接激活stat3和stat5[8,9]。另外，除了jaksstats信号传导途径之外，gp130与epor还参与激活ras/map激酶途径传导信号[10,11]。m.kawahara等学者首次构建eporgp130异源二聚体，并将其应用于amega体系中，结果发现，与单独转染epor vh/vl或gp130vh/vl的细胞株相比，转染eporgp130vh/vl的细胞株表现出相同的，甚至更好的抗原剂量依赖性生长[12]。

    本研究采用多基因共表达载体pvitro，由于其具有两个不同的转录单元，hferh启动子和hferl启动子可分别启动两个转录单元的表达，使l链和heg链在细胞内可无干扰的高水平表达，它与两个单独的载体共转染一个细胞相比要更有效、更方便。我们应用此载体成功构建细胞因子受体抗人afp嵌合抗体真核表达载体pvitroegig，并将用此表达载体转染依赖il3生长的小鼠前b细胞株（ba/f3细胞）以证实抗afp嵌合抗体能与抗原afp高亲和性结合，激发细胞因子胞内生长信号的传导，从而实现抗原介导的细胞大量扩增。

【参考文献】

  1 董志伟,王琰.抗体工程[m].北京: 北京医科大学出版社, 2002:7.

2 chung j y, kim t k, lee g m. morphological selection of parental chinese hamster ovary cell clones exhibiting highlevel expression of recombinant protein[j]. biotechniques, 2000,29(4): 768-774.

3 kawahara m, ueda h, tsumoto k, et al. amega: antigenmediated genetically modified cell amplification[j]. immunological methods , 2004, 284(1):187-194.

4 coloma m j, hastings a, wims l a, et al. novel vectors for the expression of antibody molecules using variable regions generated by polymerase chain reaction[j]. immunological methods.1992,152(1):89-104.

5 张平,蔡美英,赵宗容,等.抗人afp单链抗体基因的构建和在大肠杆菌中的表达[j].四川大学学报(医学版),2005,36（1）：20-23.

6 heinrich p c, behrmann i, mullernewen g, et al. interleukin6type cytokine signalling through the gp130/jak/stat pathway[j]. biochem. 1998, 334(2): 297-314.

7 klingmuller u, bergelson s, hsiao,j g, et al. multiple tyrosine residues in the cytosolic domain of the erythropoietin receptor promote activation of stat5[j]. proceedings of the national academy of sciences of the united states of america. 1996, 93(16): 8324-8328.

8 matsuda t, nakamura t, nakao k, et al. stat3 activation is sufficient to maintain an undifferentiated state of mouse embryonic stem cells[j]. embo. 1999,18(15): 4261-4269.

9 wooten d k, xie x, bartos d, et al. cytokine signaling through stat3 activates integrins, promotes adesion, and induces growth arrest in the myeloid cell line 32d[j]. biol. chem. 2000, 275(34): 2656626575.

10 terstegen l, gatsios p, bode j g, et al. the inhibition of interleukin6dependent stat activation by mitogenactivated protein kinases depends on tyrosine 759 in the cytoplasmic tail of glycoprotein 130[j]. biol. chem. 2000, 275(25): 18810-18817.

11 wojchowski d m, gregory r c, miller c p, et al. signal transduction in the erythropoietin receptor system[j]. experimental cell research. 1999,253(1):143-156.

真核细胞篇2

【关键词】 epor；gp130；嵌合抗体；克隆

单克隆抗体技术自1975年问世以来，在生命科学研究及临床疾病检验、治疗等方面的应用日益广泛，然而单克隆抗体多来源于小鼠，使其在体内的应用受到一定限制，因此需对单克隆抗体进行人源化改造。欧美正式批准上市，以及正在临床试用的治疗性单抗中以人源化鼠单抗数量为多。在抗体的制备过程中，抗体的表达载体系统多采用二氢叶酸还原酶（dhfr）基因作为可扩增选择标志基因，同时在培养基中加入甲氨蝶呤（mtx）来得到高拷贝量的抗体表达[1]。但是，mtx具有细胞毒性，会抑制细胞生长、引起细胞形态改变[2]。WWW.133229.COm为了避免抗生素筛选药物对细胞的影响，各国学者做了大量研究。日本学者m.kawahara等人在2003年成功构建了抗原介导的遗传修饰细胞扩增体系（antigenmediated genetically modified cell amplification,amega），将抗体的vl、vh与epor d2功能区和gp130跨膜功能区嵌合表达于细胞膜上，在细胞培养基中加入抗原，通过抗原与抗体的结合，有效地激发细胞因子胞内生长信号的传导，从而大量扩增细胞[3]。本研究借鉴这一细胞扩增体系构建细胞因子受体抗人afp人鼠嵌合抗体基因，探索获得高表达全抗体的新方法。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株、质粒大肠杆菌菌株e. coli dh5α由本室保存。pgemteasy载体购自美国promega公司。载体pag4622、pah4604均由海军总医院王琰教授惠赠。质粒pvitro2购自美国invivogen公司。抗人afp单链抗体表达载体pet32/scfv由本室构建。

1.1.2实验标本标本来源于人胚胎肝脏组织，均取自非疾病死亡的引产胎儿，胎龄28周，胚胎的使用已得到医院和产妇的同意。

1.1.3主要试剂trizol reagent购自美国gibco brl公司。one step rna pcr kit（amv）、ex taq、t4 dna ligase及各种限制酶均购自大连takara公司。胶回收纯化试剂盒、质粒抽提试剂盒均购自美国omega公司。寡核苷酸引物由上海英骏生物技术有限公司合成（表1）。表1 pcr引物的名称和序列

1. 2方法

1. 2. 1 epor胞外区基因及gp130跨膜区基因的克隆和拼接trizol法提取4月孕流产胎儿肝脏总rna，用epf1/epr1引物对扩增epor胞外区基因，用gpf/gpr引物对扩增gp130跨膜区基因，rtpcr反应条件为50 ℃逆转录30 min，94 ℃预变性5 min，然后94 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃1 min，30个循环，最后72 ℃延伸10 min。胶回收纯化rtpcr反应产物epor1和gp130，并分别克隆到pgemt easy载体上，测序鉴定。用epf2/epr2引物对从epor1t载体上扩增epor胞外区基因，在其5′加入肠激酶（enterokinase）的碱基序列：gacgacgacgacaag，胶回收纯化pcr反应产物epor2，并克隆到pgemt easy载体上，测序鉴定。用hindⅲ和claⅰ双酶切gp130t载体中的gp130跨膜区基因，和相应酶切的epor2t载体连接，获得eeporgp130t载体。

1. 2. 2人鼠嵌合抗体轻链载体的构建用vlf/vlr引物对从抗afp单链抗体表达载体pet32/scfv中扩增vl基因，用clf/clr引物对从含有人kappa轻链恒定区序列的载体pag4622中扩增cl基因[4]，分别克隆到pgemt easy载体上，测序鉴定。用bglⅱ和ecorⅰ双酶切vlt载体中的vl基因，和相应酶切的载体pvitro连接，获得pvitrovl载体。用ecorⅰ和xhoⅰ双酶切clt载体中的cl基因和相应酶切的载体pvitro连接，获得pvitrol载体。

1. 2. 3人鼠嵌合抗体重链载体的构建用vhf1/vhr引物对从抗afp单链抗体表达载体pet32/scfv中扩增vh1基因，克隆到pgemt easy载体上，测序鉴定。用ecor v和nheⅰ双酶切vh1t载体中的vh基因，和相应酶切的含有人gamma1重链恒定区序列的载体pah4604连接[4]，获得vhpah4604载体。用vhf2/chr引物对从vhpah4604载体中扩增人鼠嵌合重链基因vhch，克隆到pgemteasy载体上，测序鉴定。

1. 2. 4细胞因子受体抗人afp嵌合抗体表达载体的构建用bamhⅰ和kpnⅰ双酶切vhcht载体中的vhch基因，和相应酶切的eeporgp130t载体连接，获得heporgp130t载体。用bamhⅰ和claⅰ双酶切heporgp130t载体中的heporgp130基因，和相应酶切的pvitrol载体连接，获得pvitroegig载体（见图1）。

2结果

2. 1epor胞外区基因及gp130跨膜区基因的克隆

trizol法从4月孕胎肝组织中提取总rna，琼脂糖凝胶电泳示：28s和18s条带清晰，且28s:18 s＞1。rtpcr扩增epor和gp130，epor胞外区基因750bp，gp130跨膜区基因900bp，与预计大小一致（见图2）。epor和gp130分别克隆到pgemt easy载体，测序结果经blast比对，与genebank中报导一致。

2. 2细胞因子受体抗人afp嵌合抗体表达载体的构建

重组载体pvitroegig经相应酶切后，分别获得epor胞外区，gp130跨膜区，及嵌合轻链和重链，人鼠嵌合轻链基因630bp，嵌合重链基因1929bp，与预计大小一致（见图3）。结果表明，细胞因子受体抗人afp人鼠嵌合抗体真核表达载体构建成功。

3讨论

甲胎蛋白（alphafetoprotein，afp）是原发性肝癌诊断和生物治疗的一种重要肿瘤相关靶抗原，抗afp单抗多用于肝癌的放射免疫显像和导向治疗。但是单抗为鼠源性，应用于人体时可在体内产生人抗小鼠抗体（hama），既影响单抗的治疗效果，又有可能诱发过敏反应；此外，鼠单抗在人体内的半寿期较短，不能有效激活人体的补体依赖的细胞毒（cdc）作用及抗体依赖的细胞毒（adcc）作用。因此，通过用人igg抗体恒定区取代鼠单抗恒定区进行人源化，可消除其大部分异源性，并能保留亲本鼠单抗结合抗原的特异性和亲和力。迄今已构建了很多人鼠嵌合抗体，通过大量的实验和应用证明嵌合抗体确实保留了亲本鼠单抗的抗原结合能力并能降低免疫原性[1]。由本室制备的抗人afp单链抗体具有较高的生物活性，竞争elisa实验显示：以单克隆抗体为阳性对照，抗afp单链抗体可抑制53%的单克隆抗体与抗原afp结合[5]。因此可以将其vl/vh链作为新的嵌合受体的识别单位，通过抗原afp与抗体vl/vh特异性结合，诱发eporgp130融合蛋白的聚合,从而激发细胞生长信号传导，筛选出能与抗原高亲和性结合的抗体表达细胞[3]。

促红细胞生成素受体（erythropoietin receptor，epor）是ⅰ型细胞因子受体超家族成员。 gp130是白细胞介素6（il6）、白血病抑制因子（lif）、抑瘤素m（osm）、睫状神经营养因子（cntf）、白细胞介素11（il11）和心肌营养素1（ct1）所共用的受体和信号传导子[6]。虽然epor与gp130在结构和功能上不尽相同，但是二者之间有很多相似之处。epor与gp130均可结合并激活酪氨酸激酶（janus kinases，jaks），激活的jaks可活化信号转导与转录活化子（signal transducer and activators of transcriptions，stats），使其酪氨酸残基磷酸化，并结合成二聚体转位到胞核内，与特异的靶序列增强子结合调节基因转录[6,7]。也有文献报道gp130与epor分别可直接激活stat3和stat5[8,9]。另外，除了jaksstats信号传导途径之外，gp130与epor还参与激活ras/map激酶途径传导信号[10,11]。m.kawahara等学者首次构建eporgp130异源二聚体，并将其应用于amega体系中，结果发现，与单独转染epor vh/vl或gp130vh/vl的细胞株相比，转染eporgp130vh/vl的细胞株表现出相同的，甚至更好的抗原剂量依赖性生长[12]。

本研究采用多基因共表达载体pvitro，由于其具有两个不同的转录单元，hferh启动子和hferl启动子可分别启动两个转录单元的表达，使l链和heg链在细胞内可无干扰的高水平表达，它与两个单独的载体共转染一个细胞相比要更有效、更方便。我们应用此载体成功构建细胞因子受体抗人afp嵌合抗体真核表达载体pvitroegig，并将用此表达载体转染依赖il3生长的小鼠前b细胞株（ba/f3细胞）以证实抗afp嵌合抗体能与抗原afp高亲和性结合，激发细胞因子胞内生长信号的传导，从而实现抗原介导的细胞大量扩增。

【参考文献】

1 董志伟,王琰.抗体工程[m].北京: 北京医科大学出版社, 2002:7.

2 chung j y, kim t k, lee g m. morphological selection of parental chinese hamster ovary cell clones exhibiting highlevel expression of recombinant protein[j]. biotechniques, 2000,29(4): 768-774.

3 kawahara m, ueda h, tsumoto k, et al. amega: antigenmediated genetically modified cell amplification[j]. immunological methods , 2004, 284(1):187-194.

4 coloma m j, hastings a, wims l a, et al. novel vectors for the expression of antibody molecules using variable regions generated by polymerase chain reaction[j]. immunological methods.1992,152(1):89-104.

5 张平,蔡美英,赵宗容,等.抗人afp单链抗体基因的构建和在大肠杆菌中的表达[j].四川大学学报(医学版),2005,36（1）：20-23.

6 heinrich p c, behrmann i, mullernewen g, et al. interleukin6type cytokine signalling through the gp130/jak/stat pathway[j]. biochem. 1998, 334(2): 297-314.

7 klingmuller u, bergelson s, hsiao,j g, et al. multiple tyrosine residues in the cytosolic domain of the erythropoietin receptor promote activation of stat5[j]. proceedings of the national academy of sciences of the united states of america. 1996, 93(16): 8324-8328.

8 matsuda t, nakamura t, nakao k, et al. stat3 activation is sufficient to maintain an undifferentiated state of mouse embryonic stem cells[j]. embo. 1999,18(15): 4261-4269.

9 wooten d k, xie x, bartos d, et al. cytokine signaling through stat3 activates integrins, promotes adesion, and induces growth arrest in the myeloid cell line 32d[j]. biol. chem. 2000, 275(34): 2656626575.

10 terstegen l, gatsios p, bode j g, et al. the inhibition of interleukin6dependent stat activation by mitogenactivated protein kinases depends on tyrosine 759 in the cytoplasmic tail of glycoprotein 130[j]. biol. chem. 2000, 275(25): 18810-18817.

11 wojchowski d m, gregory r c, miller c p, et al. signal transduction in the erythropoietin receptor system[j]. experimental cell research. 1999,253(1):143-156.

真核细胞篇3

【关键词】 巨噬细胞 细胞特异性 动子 真核表达载体 胞内菌感染 基因治疗

胞内菌感染的治疗一直是临床上棘手的问题之一。常见的胞内感染细菌主要有结核杆菌、 伤寒沙门氏菌等。这些胞内感染菌突破人体第一道防线后， 在体内首先遇到巨噬细胞的吞噬和杀灭。然而在很多情况下巨噬细胞虽能吞噬这些细菌， 却并不能彻底杀死它们， 反而变成了胞内菌的庇护所[1]。另外， 由于大多数抗菌药在细胞内的浓度低， 导致胞内菌不能被有效杀灭， 而且胞内菌感染的治疗疗程长， 容易导致毒副反应的发生和耐药性的出现， 更使其治疗困难[2]。因此， 针对胞内菌感染的治疗， 新型抗菌药物和治疗方法的开发及应用显得尤其重要。我们前期成功构建了抗菌肽基因的真核表达载体， 并在小鼠巨噬细RAW264.7中成功表达了抗菌肽， 发挥了杀灭胞内菌的作用(待发表)。但是由于抗菌肽具有一定的毒副作用， 会对机体正常细胞产生损伤作用。为了减少抗菌肽对机体正常细胞的毒副作用， 增强目的基因表达的特异性和基因治疗的靶向性， 本研究中我们构建了巨噬细胞特异性启动子调控的靶向巨噬细胞的真核表达载体， 并利用绿色荧光蛋白（GFP）和红色荧光蛋白（RFP）作为报告基因研究了该启动子在不同种类细胞中表达的特异性。

1 材料和方法

1.1 材料

真核表达质粒pEGFPN1和pERFPN1为Clontech公司产品。大肠杆菌DH5α由本室保存。高保真聚合酶、 逆转录酶、 连接酶、

DNA marker等购自大连TaKaRa公司。限制性内切酶Vsp I和Kpn I购自上海生工生物有限公司。胶回收试剂盒、 质粒提取和RNA提取试剂盒购自上海华舜公司。Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司。RPMI1640和DMEM培养基购自Gibco公司。其他试剂为国产分析纯试剂。小鼠巨噬细胞株RAW264.7、 人结肠癌细胞株Lovo、 人肝癌细胞株HepG2、 人乳腺癌细胞株ZR7530、 非洲绿猴肾细胞株COS7均由本室保存。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计与合成及巨噬细胞特异性启动子的拼接合成 根据GenBank（登录号: DQ107382）和参考文献[3]报道的巨噬细胞特异性启动子序列设计拼接引物， 序列为P1: 5′GGCGCATTAATAAGCGACTTCCTCTTTCCAGCAGAAAAGGAGAAGTAGGAGCCAAGATTTCCAAACTCTGTGGTTGCCTTG3

′， P2:5′ACGAGCTCCTACTTCTCCTTTTCTGCTGGAAAGAGGAAGTCGCTTCTGGAAAGAGGAAGTCGCTTCAAGGCAACCACAGAGTTTGG3′， P3: 5′

ACGAGCTCCTACTTCTCCTTTTCTGCCAAGATTTCCAAACTCTGTGGTTGCCTTG3′， P4: 5′CTTCTCCTTTT

CTGCAGAAAAGGAGAAGTAGGAGCAAGGCAACCACAGAGTTTG3′， P5: 5′CTTTTCTGCAGAAAAGGAGAAGTAGGAGCTGGAAAGAGGAAGTCGCTTTACCCTCCC3′

， P6: 5′GAGGAAGTCGCTTTTGTCGCGGTCGGGACAGGGGGCAGGGAGGGTAAAGCGACTTCC3′， P7: 5′

GCGACAAAAGCGACTTCCTCTTTCCAGTGCATTTAAGGCGCAGCCTGGAAGTGCCAGG3′， P8: 5′GGGGTACCGCTAGCGACTGGGTGGCCTCCAGTGCTCCCTGGCACTTCCAGGCTGCG3′。其中划线处分别为为Vsp I和Kpn I的酶切位点， 引物由上海生工生物有限公司合成。以P1和P8为引物， P2～P7为模版通过PCR

方法拼接合成巨噬细胞特异性启动子序列， 反应条件如下: 98℃ 10 s， 68℃ 30 s， 共30个循环; 72℃ 5 min。扩增产物用10 g/L琼脂糖凝胶

电泳检测。

1.2.2 巨噬细胞启动子的克隆及测序鉴定

PCR产物电泳后经胶回收试剂盒纯化， 与真核表达载体pEGFPN1用Vsp I和Kpn I进行双酶切， 酶切

片段回收后16℃连接过夜， 连接产物用氯化钙方法转化大肠杆菌DH5α， 菌落PCR方法筛选阳性菌落， 提取质粒进行双酶切鉴定， 并送测序。测序正确的载体命名为pSPGFP。

1.2.3 细胞培养及转染 小鼠巨噬细胞株RAW264.7、 人结肠癌细胞株Lovo、 人肝癌细胞株HepG2、 人乳腺癌细胞株ZR7530、 非洲绿猴肾细胞株COS7用含有100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液， 在37℃50mL/LCO2孵箱中常规培养。转染前1 d铺24孔板， 次日将质粒pSPGFP和pERFPN1按摩尔比1∶1混合， 按转染试剂盒操作说明进行转染。48 h后用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的表达。

2 结果

2.1 结巨噬细胞启动子的拼接合成

通过拼接PCR方法合成了巨噬细胞特异性的启动子序列， 片段大小为350 bp左右， 与理论预测大小相符（图1）。

2.2 巨噬细胞特异性真核表达载体的构建和酶切鉴定 PCR产物经双酶切后插入真核表达载体pEGFPN1， 替代CMV启动子得到重组表达载体。

对重组载体进行Vsp I和Kpn I双酶切鉴定， 得到1条约350 bp的DNA片段（图2）， 与理论预测值一致。经测序鉴定序列正确（测序图略）， 命名为pSPGFP。

2.3 转染重组质粒的细胞中GFP的表达

重组质粒pSPGFP与内参对照质粒pERFPN1按等摩尔比共转染各种细胞株。作为内参的报告基因RFP在各细胞株中均为高表达。GFP则仅在小鼠巨噬细胞RAW264.7中高表达， 表达强度与RFP相近; 而在其他非巨噬细胞中， GFP几乎没有表达（图3）。这说明我们构建的巨噬细胞特异性载体能够靶向巨噬细胞高效表达报告基因GFP。

3 讨论

采用基因治疗的方法来治疗胞内菌感染， 尤其是难治性胞内菌感染， 是一种新型有效的治疗策略。但是， 由于基因治疗的载体往往缺乏靶向性， 当载体进入机体后表达的目的基因往往会对正常组织细胞产生毒副作用， 造成机体损伤。所以， 基因治疗的靶向性是决定基因治疗成功与否的关键点之一， 也是目前基因治疗的研究热点[4]。

巨噬细胞靶向性的基因表达的主要机制就是用巨噬细胞特异性的启动子来启动目的基因的表达， 使目的基因的表达仅限于巨噬细胞， 从而减轻其对正常组织细胞的损伤。现已广泛应用于动脉粥样硬化等[3， 5， 6]疾病的治疗研究。

在本实验中， 我们合成了巨噬细胞特异性的启动子序列， 并以之替代pEGFPN1载体的CMV启动子， 成功构建了巨噬细胞特异性启动子调控的真核表达载体pSPGFP。通过转染巨噬细胞和多种非巨噬细胞， 观察GFP表达效率来验证该启动子的巨噬细胞靶向性。为了平衡各实验组间的细胞数、 细胞状态和转染效率等因素的差异对GFP表达的影响， 本实验中我们利用表达红色荧光蛋白的pERFPN1载体作为转染的内参照， 与重组载体共转染靶细胞， 通过比较GFP和RFP的表达差异来判断启动子的表达特异性。此方法比单独使用GFP[7， 8]更准确。而与利用海肾萤光素酶等作为内参照的双萤光素酶报告系统[9]相比， 该方法更简变、 更直观而且无需特殊的检测仪器。实验结果表明， 以巨噬细胞特异性启动子启动的GFP可以在巨噬细胞中高效表达， 在非巨噬细胞中则几乎没有表达; 而以CMV启动子启动的RFP在巨噬细胞和非巨噬细胞中均有表达。这说明我们构建的巨噬细胞特异性真核表达载体可以在巨噬细胞中特异性的表达目的基因， 为靶向巨噬细胞的基因治疗提供了新的思路和实验基础。

参考文献

[1] Leemans JC， Thepen T， Weijer S， et al. Macropahges play a dual role during pulmonary tuberculosis in mice[J]. J Infect Dis， 2005， 191(1): 65-74.

[2] 罗家琴， 李富祥， 张以芳. 抗胞内菌感染免疫及其治疗[J]. 微生物学杂志， 2004， 24（2）: 46-39.

[3] He WJ， Qiang M， Ma WQ， et al. Development of a synthetic promoter for macrophage gene therapy[J]. Hum Gene Ther， 2006， 17(9): 949-959.

[4] 高艳虹， 李定国. 基因治疗靶向方法的研究进展[J]. 中华内科杂志， 2006， 45(5): 432-434.

[5] Greaves DR， Gordon S. Macrophagespecifi gene expression: Current paradigms and future challenges[J]. Int J Hematol， 2002， 76(1): 6-15.

[6] Ferreira V， Van Dijk KW， Groen AK， et al. Macrophagespecific inhibition of NFκB activation reduces foamcell formation[J]. Atherosclerosis， 2007， 192(2): 283-290.

真核细胞篇4

doi:10.3969/j.issn.1006-1959.2010.05.010 文章编号:1006-1959(2010)-05-1035-02

SATRD7是一编码295个氨基酸残基,分子量为34.7kDa的新型蛋白质,其生物学功能至今未明。通过生物信息学分析,发现其全长序列中含有一个类固醇敏感性调节蛋白(StAR)相关脂类转运体结构域(START)。START涉及脂类结合介导的细胞信号转导、脂类转运和调节。START发生突变或错误表达与基因错配、自身免疫性疾病以及肿瘤相关。为了研究STARD7基因过表达后对肿瘤细胞生物学的影响,我们将STARD7基因克隆构建到真核表达载体上,并稳定转染到HEPG1*2肝癌细胞中。

1.材料和方法

1.1 材料:大肠杆菌DH-5α和人肝癌细胞系HepG1*2均由本实验室保存,pMD18-T载体购自大连宝生物工程有限公司,M-MLV逆转录酶购自Promega公司,各种分子克隆工具酶购自MBI公司,脂质体Lipofectamine2000、Trizol试剂、G418和pcDNA3.1(-)真核表达载体购自Invitrogen公司,RPMI1640、胎牛血清(FBS)等购自GIBCOBRL公司。

1.2 方法。

1.2.1 HepG1*2总RNA的提取。按照Trizol试剂说明书步骤提取总RNA。收集所培养的HepG1*2,加TRIZOL试剂1mL,静置3~5min。加入氯仿0.5ml,混匀。室温静置2~3min后,12000r/min离心15min。于上清中加人0.5ml异丙醇,室温静置10min。10000r/min离心10min。弃上清,加入750ml/L乙醇1ml,7500r/min离心5min,干燥沉淀,加入30μL DEPC处理水。经琼脂糖凝胶电泳显示无降解后,用紫外分光光度计测定其纯度并定量,保存于-80℃备用。

1.2.2 引物设计。根据GenBank的基因序列(NM_064536),设计扩增STARD7编码区cDNA上、下游引物。上、下游引物中分别引入SamⅠ、Xhol酶切位点,扩增片段为880bp。上游5' CTCGAGATGGCGGCGTTAGCC 3',下游5' CCCGGGAGCATACTCAATC 3';内参照β-actin的引物序列为:上游5' TGTGACGTGGACATCCGCAAAG 3',下游5' TGGAAGGTGGACAGCGAGGC 3',扩增片段为206bp。并设计作为转染HepG1*2细胞后鉴定用的G418抗性基因PGK neo的特异性引物:上游5'-AGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTG 3',下游5'-AAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCG 3',扩增片段为492bp。所有引物均由Invitrogen公司合成。

1.2.3 逆转录合成cDNA逆转录。反应体系为:细胞总RNA 1μg,H2O 13μL,oligdT 0.5μg,70℃ 5min,立刻冰上放置,加入M-MLV 200u,dNTP 10nmol,5×M-MLV Buffer 5μL,Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor 25u,混匀后42℃ 1h,70℃ 10min。取10μL反转录产物进行PCR反应,采用降落PCR(Touch down_PCR),反应条件:94℃预变性4min;94℃变性30s,63℃退火30s,72℃延伸40s扩增35个循环,72℃延伸7min。PCR产物经15g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定后,切胶回收目的片段。

1.2.4 T载体克隆。对PCR产物进行割胶纯化,将目的片段与pMD18-T载体连接。连接反应体系为:Solution I 5μL,pMD18-T DNA 50ng,PCR产物50ng,ddH2O 3μL,置于16℃ 2h后,连接产物转化大肠杆菌DH-5α感受态,在氨苄青霉素抗性平板上筛选生长,挑取单克隆菌落。阳性克隆经酶切鉴定,并命名为:pMD18-T/STARD7。

1.2.5 真核表达载体pcDNA3.1(-)/STARD7的构建用Sam I、Xho I分别双酶切重组pMD18-T/STARD7质粒及pcDNA3.1(-)空载体,凝胶电泳后回收目的片段,16℃连接10h。连接、转化,方法同前。阳性克隆经酶切鉴定后测序(Invitrogen公司)。测序正确后扩大培养,抽提重组质粒DNA。

1.2.6 细胞培养。HepG1*2细胞在含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液中,于37℃、50mL/LCO2饱和湿度的孵箱中培养。

1.2.7 HepG1*2细胞的基因转染和筛选培养。将处于对数生长期的HepG1*2细胞以4×105个细胞/孔接种于六孔板中,培养24h,使细胞达到80%～90%融合。用脂质体Lipofectamine2000介导空质粒及重组质粒转染细胞。转染前1h先予细胞更换无血清培养基,使细胞适应条件变更。并准备以下2种溶液,A液:4μg质粒DNA溶于150μL无血清培养液中;B液:4μL脂质体溶于150μL无血清培养液中。将A液与B液混匀,室温孵育30min,以形成DNA-脂质体复合体,加入培养液中。培养8~14h,更换为完全培养液,继续培养24h,次日于完全培养液中加入800mg/L的G418继续进行培养,2周后G418浓度改为400mg/L维持筛选。用选择培养液培养4周后,分离阳性克隆并扩大培养备用。

1.2.8 转染后STARD7表达的鉴定。分别以β-actin为内参照,对STARD7基因在转染细胞内目的基因的mRNA及蛋白表达情况进行鉴定。分别收集稳定转染空载体重组质粒的细胞,样品处理后进行常规聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、TBST缓冲液洗膜、50g/L脱脂牛奶封闭。一抗为STARD7小鼠多抗,二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG,ECL显色。

2.结果

2.1 总RNA提取。用一步法成功提取HepG1*2总RNA,总RNA电泳结果可见有5S、18S和28S三条带。

2.2 RT-PCR扩增产物的鉴定及真核表达载体的构建与鉴定。HepG1*2总RNA经RT-PCR扩增,扩增产物电泳结果可见在约880bp处有一特异性扩增条带(图2),与预期的扩增片段大小相符。将用SamI、Xho I双酶切重组质粒pMD18-T/STARD7得到的目的基因插入pcDNA 3.1(-)空质粒,获得pcDNA3.1(-)/STARD7真核表达质粒,该质粒再经SamI、Xho I双酶切鉴定,得到了880bp的目的片段和约5400bp的载体片段(图1),送测序证实该质粒含有完全正确的STARD7 cDNA序列。

图1 RT-PCR扩增产物及重组质粒pcDNA3.1(-)/STARD7双酶切鉴定

M:DL2000 DNA marker;1:pcDNA3.1(-);2:pcDNA3.1(-)/STARD7;3:STARD7 RT-PCR扩增产物。

2.3 稳定表达株的筛选与鉴定。将pcDNA3.1(-)/STARD7质粒转染入人肝癌细胞系HepG1*2,经4周选择性培养(400mg/LG418)后,得到了稳定表达目的基因mRNA的阳性细胞株。采用STARD7半定量引物进行RT-PCR扩增,在采用G418抗性基因PGK neo引物进行的扩增中,转染pcDNA3.1(-)/STARD7及pcDNA3.1(-)空载体的HepG1*2细胞均得到一条大小为492bp的PGK neo条带,而未转染的HepG1*2细胞没有扩增出该条带,说明pcDNA3.1(-)空载体和pcDNA3.1(-)/STARD7均已转入到HEPG1*2细胞中(图2)。筛选后的STARD7稳定表达细胞经RT-PCR及Western blot方法分析,转染了pcDNA3.1(-)/STARD7的HEPG1*2细胞与对照转染空载体及未转染的HepG1*2细胞相比,转染了pcDNA3.1(-)/STARD7的HepG1*2细胞扩增后的STARD7目的条带明显比对照转染空载体的亮,说明重组子已成功转入HepG1*2细胞并得到表达(图3、4)。

1:HepG1*2;2:HepG1*2/pcDNA3.1(-); 3:HepG1*2/pcDNA3.1(-)/STARD7:M:DL2000

图2 pcDNA3.1(-)/STARD7重组细胞G418鉴定图

Fig 2.Identification of G418 in reconstituted cell pcDNA3.1(-)/STARD7

M:DL 2000;1:HepG1*2;2:HepG1*2/pcDNA3.1(-);3:HepG1*2/pcDNA3.1(-)/STARD7

图3 各转染组细胞STARD7基因的mRNA水平变化

Fig 3 Expression of STARD7 mRNA in different transfected cells

1,2:转染空载体的HepG1*2细胞;3,4:转染STARD7的HepG1*2细胞

图4 Western-blot检测重组细胞STARD7表达

Fig.4 The expression of STARD7 transfected with HepG1*2

3.讨论

STARD7是一编码295个氨基酸残基,分子量为34.7kDa的新型蛋白质,其生物学功能至今未明。通过生物信息学分析,发现其全长序列中含有一个类固醇敏感性调节蛋白(StAR)相关脂类转运体结构域(START)。为进一步研究STARD7过表达后对肿瘤细胞的生物学功能的影响,在本实验中我们将此基因构建在真核细胞表达载体pcDNA3.1(-),经限制性核酸内切酶酶切鉴定、测序证实目的基因STARD7序列正确,成功构建重组子pcDNA/STARD7。然后将所构建的含STARD7基因的重组质粒转染到HepG1*2细胞,并用G418筛选稳定转染细胞株,选择抗性克隆,将新的克隆细胞挑选出扩大培养。为了鉴定STARD7基因是否已经转染到HepG1*2细胞中,我们通过扩增G418抗性基因PGKneo序列来鉴定,因为pcDNA3.1(-)中带有G418抗性基因PGKneo,该序列是很特异的,人的HepG1*2细胞中不含有该序列,如果没有转染的细胞,那么就扩增不出492bp的特异条带。而且转染了STARD7基因的HepG1*2细胞,其STARD7目的条带比转染了空质粒的HepG1*2及未转染的HepG1*2细胞在mRNA水平及蛋白水平表达量均增加,表明STARD7基因已经转染到HepG1*2细胞中并且有此蛋白的过量表达。本实验为进一步研究STARD7基因对肿瘤细胞的生物学功能的影响奠定了实验基础。

参考文献

[1] John Colicelli.Human RAS Superfamily Proteins and Related GTPases[J].Sci.STKE,2004,(250),re13.

[2] Larry A.Feig.Ral-GTPases:approaching their 15 minutes of fame[J].TRENDS in Cell Biology Vol.13 No.8 419-425(7) August 2003.

真核细胞篇5

关键词：HBV X蛋白：真核表达；乙型肝炎病毒：细胞模型

中图分类号：R575.3　文献标识码：A　文章编号：1007-7847(2007)04-0355-06

乙型肝炎病毒X基因(HBV X)及其编码的多功能蛋白 (HBX)在乙肝相关的肝细胞癌(HCC)发生发展中起着重要的作用。但关于HBX能否直接转化肝细胞一直存在着争议，其原因之一可能是缺乏合适的体外模型，我们以人源性永生化非瘤性肝细胞株OSG7701为靶细胞，将HBv X导人OSC7701细胞，建立表达HBX蛋白的肝细胞模型，为探讨HBX在HBV相关HCC的发生发展过程中的作用提供一个有价值的平台。

1　材料与方法

1．1　材料

1．1．1　载体、菌株及细胞株

pGEM-T Easy Vector为美国homeCa公司产品，真核表达质粒pRc/CMV2购自Sigma公司，E.coli DH5a及人源性肝细胞株QSG7701，为本实验室保存。

1．1．2　主要试剂

Taq DNA聚合酶、10mmol/L dNTP为日本Takara公司产品：血清HBV裂解缓冲液为上海申友生物公司产品：快速连接试剂盒、限制性内切酶Apa I和HindⅢ及DNA分子量Marker均为BBI公司产品；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、无内毒素质粒小提试剂盒、TRANSfection转染试剂盒、细胞基因组DNA提取试剂盒均为北京TIANGEN生物技术公司产品；胎牛血清购自杭州赛乐生物公司：高糖DMEM为美国GIBCO公司产品：G418、蛋白分子量Marker为上海生工生物工程公司产品；Trizol为美国MRC公司产品：逆转录试剂盒为Fermentas公司产品；鼠抗人HBX单克隆抗体为德国abcam公司产品；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG、硝酸纤维素膜为ProMab公司产品：蛋白质抽提试剂盒、ECL化学发光试剂盒均为PIERCE公司产品。

1．1．3　引物

针对人HBV X基因序列的PCR引物由于akara公司合成，引物源于已发表的序列，正义5'-AAA GCTTCCA TG GCTGCTCGGGGTTG-3'：反义5'-A GGGCCCTTA GGCAGAGGTGAAAAAG-3'(正义链含有HindⅢ酶切位点和起始密码子，反义链含Apa I酶切位点和终止密码子)，目的片断大小为481bp.人β-actin，actin引物由北京鼎国生物公司合成，正义5'-TAACTGGAACGGTGAAGGTG-3'：反义5'-AGGGCACGAAGGGGCTCATCAT-3'，目的片断大小为316bp。

1．2　方法

1．2．1　HBV X基因的扩增与克隆

采乙肝患者静脉血(经湘雅医院感染病科实验室检测乙肝三项定量示：HbsAg阳性，HbeAg阳性，ttbcAb阳性)，以碱裂解法提取DNA，以此为模板，扩增HBV X基因片断，反应体系为25μL，其中含模板DNA 3μL，dNTP 1μL，上下游引物2μL，Taq DNA polymerase lμL，扩增条件为95℃5min，94℃50s，57℃50s，72℃1min，共扩增35个循环，最后72℃8min，用1.0％低熔点琼脂糖凝胶分离PCR产物，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收纯化目的片断，与pGEM-了载体连接，连接产物命名为pGEM/X，转化感受态细菌E.coli DH5a，Amp的LB/X-gal选择性培养基筛选白色菌落，增菌后碱裂解小量抽提法提取质粒，Apa I/HindⅢ双酶切鉴定。

1．2．2真核表达质粒pCMV/X的构建及鉴定

小量提取真核表达载体pRc/CMV2及重组质粒pGEM/X，分别用Apo I和HindⅢ双酶切，X基因及质粒载体均用1.0％琼脂糖凝胶电泳、凝胶回收试剂盒回收纯化。用快速连接试剂盒进行连接，连接产物命名为pCMV/X，转化DH5a感受态细菌，挑取阳性单菌落，增菌并提取质粒，ApaI/HindⅢ双酶切鉴定，并送上海生工生物工程公司测序。

1．2．3　QSG7701细胞的培养及稳定转染

QSG7701细胞用含10％胎牛血清的DMEM培养基中于37℃、5％V/V C02培养箱中培养，待细胞生长至约85％的融合状态进行传代，按TRANSfection转染试剂盒提供的方法，以质粒pRc/CMV2及pCMV/X，分别转染QSG7701，实验分3组，分别为QSG7701细胞未转染组：QSG7701转染pRc/CMV2组(简称pRcCMV2/QSG)，QSG7701细胞转染重组质粒pCMV/X组(简称pCMV X/QSG)，细胞转染质粒4d后，在3组细胞的完全培养基中加入G418筛选，前2dG418浓度为200mg/L，然后将G418加量为400mg/L，共筛选2周，隔天换液，直至未转染质粒的阴性对照组全部死亡，而转染组的细胞有抗性克隆出现，以200mg/L G418维持筛选20d，然后挑取单个克隆扩大培养，建立稳定转染的细胞系，即pCMV X/QSG和pRcCMV2/QSG细胞系。

1．2．4　转染细胞中目的基因DNA的鉴定

用细胞基因组DNA提取试剂盒提取转染细胞中的基因DNA，PCR法扩增鉴定HBV X基因。

1．2．5　转染细胞的总RNA的提取及PT-PCR鉴定

采用Trizol试剂提取转染细胞中的总RNA。通过RT-PCR扩增HBV X mRNA基因。

1．2．6 表达产物的Western blottin~鉴定

在冰上按蛋白提取试剂盒操作步骤提取细胞蛋白质，加入适量2XSDS凝胶加样缓冲液(50mmol/L Tris HCl，pH 6.8；100mmol/L DTT：2％SDS；0.1％溴酚蓝；10％甘油)，100℃煮沸3min，使蛋白质变性，经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转移至硝酸纤维素膜上，硝酸纤维素膜在5％脱脂牛奶(5g脱脂牛奶+100mL PBS)中室温封闭1h，分别加入特异性HBX抗体(1:50)和

GAPDH抗体(1:2000)，37℃水平摇床孵育1h，4℃过夜，PBS充分洗涤后分别加入辣根过氧化物酶标记的相应的二抗。即猴抗羊IgG(1:1000)和羊抗鼠IgG(1:1000)，37℃水平摇床孵育2h，充分洗涤后，化学发光试剂(ECL)A液和B液混合后加至硝酸纤维素膜上，暗示曝光3～5min，取出X光片，显影，定影观察结果。

2　结果与分析

2．1　PCR扩增血清中I-IBV X基因片断

以HBV感染者的血清DNA为模板，扩增出HBV X基因片段，琼脂糖凝胶电泳，目的条带出现在500bp左右的位置，与预计的481bp相符，阴性对照组是以正常人血清中提取的DNA为模板，未扩增出目的片断，见图1表明通过PCR方法已从HBV感染者血清中成功扩增出HBV X基因片段，为下一步基因克隆打下了基础。

2．2　重组质粒pGEM/X阳性克隆的筛选及鉴定

PCR产物与pGEM-T载体连接，转化感受态细菌，挑选白色菌落，增菌提取质粒，质粒经Apa I/HindⅢ双酶切，酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳，于500bp左右可见一清晰的条带，与预计的481bp相符，表明经PCR扩增的X基因片段已成功克隆人pGEM-T载体中，见图2。

2．3　重组表达质粒pCMV/X的筛选及鉴定

重组表达质粒pCMV/X经Apa I/HindⅢ双酶切后，酶切产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳，可见大小两条清晰的条带，小分子条带位于500bp左右，与HBV X基因的大小相符，表明重组表达质粒pCMV/X的构建是成功的，见图3。

2．4　重组表达质粒pCMV/X测序鉴定

重组表达质粒pCMV/X测序报告所示目的片段序列与GenBank上AYl230 HBV X基因序列一致，测序引物为T7，从第10位至478位碱基为目的片段，见图4，上述结果进一步证实已成功构建了重组表达质粒pCMV/X。

2．5　G418筛选转染细胞及克隆形成

质粒pCMV/X和pRc/CMV2分别转染QSG7701细胞后，经G418筛选2周后。作为阴性对照的未转染的QSG7701细胞全部死亡，转染细胞组有抗性细胞克隆出现，分别获得pCMV X/QSG细胞阳性克隆8个，pRcCMV2/QSG细胞阳性克隆6个，转染后的细胞在倒置显微镜下观察细胞形态与正常QSG7701细胞相比无明显变化，仍表现出上皮样细胞的特点，为扁平的多角形细胞，见图5.200 mg/L G418维持筛选的过程中，发现细胞克隆逐渐增多，增大，肉眼观察可见白色的细胞克隆，pCMV X/QSG组共25个，pRcCMV2/QSG组共19个，上述结果表明。重组表达质粒pCMV/X及质粒pRc/CMV2已分别稳定转染QSG7701细胞，并已分别获得相应细胞克隆。

2．6　转染细胞中HBV X基因鉴定

pCMV X/QSG细胞DNA经PCR扩增后，在500 bp下方出现一特异性条带，与预期片段大小481 bp一致，电泳条带清晰，无杂带，无拖尾，而pRcCMV2/QSG及未转染质粒的QSG7701细胞DNA经PCR扩增后均未见特异性片段，见图6，结果表明重组质粒pCMV X转染的QSG7701细胞中包含目的基因片段HBV X。

2．7　RT-PCR检测转染细胞中HBV X mRNA的表达

从3种细胞中提取细胞总RNA，分别进行RT-PCR扩增反应，结果显示pCMV X/QSG组在500 bp附近出现清晰的条带，与预期的481 bp吻合。而pRcCMV2/QSG及QSG7701组无目的条带出现，表明在pCMV X/QSG细胞中存在HBVX转录产物的表达，见图7，结果表明重组质粒pCMV X转染的QSG7701细胞能特异性地表达HBV X mRNA。

2．8　Western Blotting检测转染细胞中HBX的表达

pRcX/QSG细胞提取蛋白在分子质量约17kD处可检测到特异性蛋白条带，与HBVX蛋白的理论分子质量是一致的。而pRcCMV2/QSG及未转染质粒的QSG7701细胞抽提蛋白则未见HBV X蛋白表达，见图8，结果表明重组质粒pCMV X转染的QSG7701细胞能特异性地表达HBV X蛋白。

3　讨论

在HBV编码的蛋白质中，HBX是一种由154个氨基酸残基组成的多功能蛋白，大量研究表明，即使HBX对HBV的感染不是绝对必须的，它也至少在HBV的复制中起着关键的作用，因而HBX与HBV的生命周期、致病机制甚至HCC的发生发展密切相关，HBX具有广泛的反式激活功能，它虽然不能与DNA直接接合，但可以通过蛋白，蛋白相互作用，激活多种信号传导通路(如FasL/Fas、JAK/STAT、Ras/Raf和JNK传导通路等)，来调节各种信号蛋白及原癌基因的表达，而这些蛋白常参与细胞增殖、有丝分裂、分化及恶性转化等生理病理过程，HBX长期缓慢激活信号传导途径，类似于弱的肿瘤促进剂，这已成为HBX致癌的热点机制。

目前，关于HBX在HBV感染及HCC发生发展中所起的确切作用仍存在很大争议，许多研究结果甚至相互矛盾，在HBX漫长的致癌过程中，有许多因素在不同阶段参与作用，全面研究HBX生物学特性，将有助于揭示HBV相关HCC的发生和发展机制，为了进一步探讨HBX在HCC发生过程中所起的作用及其确切的分子机制，建立恰当的细胞、动物模型是至关重要的，然而，在转基因的肝细胞模型中，大多是以人或鼠肝癌细胞如HepG2、HepG2.2.15、QGY7701、Huh7等为研究对象，来探讨HBX在肝癌细胞的凋亡、分化与增殖中的信号传导通路，以及细胞癌基因的激活等方面所起的作用，而对HBV X基因及HBX蛋白对非瘤性肝细胞的影响研究甚少，HBX能否转化正常肝细胞甚至瘤性转化正常肝细胞?目前在这方面的报导极少。

因此，本研究选用了人源性非瘤性肝细胞QSG7701为研究对象。将含全长HBV X基因的真核重组表达质粒pCMV/X转染QSG7701细胞，建立HBV X稳定转染的肝细胞模型，以探讨HBX对正常人肝细胞的转化作用，首先，HBV X真核表达质粒构建的成功与否，关系到细胞模型中HBX的表达，直接影响到实验的结果，也是目前关于HBX的研究结果出现分歧的原因之一，本实验中。我们选用的真核表达载体为pRc/CMV2，在其强大的启动子SV40和CMV的作用下，HBV X基因在转染细胞中实现了高水平的转录和表达，为建立理想的细胞模型打下了基础。

在扩增HBV感染者血清中HBV X基因的引物设计及选择方面，我们考虑到HBV共有8种基因型(A-H)，基因型的差异可以引起HBX氨基酸的差异。而这些差异可导致HBX反式激活功能的不同，至于是否会导致不同的临床及病理表现，目前还不确定，亚洲地区HBV主要基因型为B型和C型，而中国人以adr亚型为主，故我们扩增HBV X的引物设计是针对adr亚型HBV X的基因序列，并成功地从“大三阳”且HBV DNA阳性患者的血清中扩增出目的HBV X片段，真核重组表达质粒pCMV/X测序目的基因，其结果与PubmedGenBank中adr亚型的HBV又序列吻合。

在HBV感染的哺乳动物中，宿主基因组DNA中常有一个或多个位点上整合有HBVDNA，这种整合可影响到癌基因或(和)抑癌基因的表达，在HCC的发生中起着一定作用，而在HBV的4个开放阅读框中，X基因是最容易整合的序列，可以部分或全部整合至宿主DNA中，在转染了HBV X的细胞中，外源基因是否整合至宿主DNA是随机的，这正好模拟了人类HBV感染后，HBV X基因的整合，在本研究中，经HBVX转染的阳性细胞克隆经PCR，RT-PCR和West，ern Blotting证实， 目的基因HBV X已导人QSG7701细胞中，并有转录产物及蛋白的表达，说明HBV X是全部整合至细胞基因组DNA中，获得了可稳定表达HBX的肝细胞株pCMV X/QSG，为下一步体外研究HBX对正常人肝细胞的转化作用，及体内研究HBX的致瘤性打搭建了一个好的平台。基于这个平台，我们可以从多方面研究HBX在HBV感染和诱发HCC中的作用。

真核细胞篇6

【摘要】

目的: 构建大鼠IL-10基因的真核表达载体， 观察其在大鼠肝细胞系BRL中的表达， 比较有无受体介导的脂质体的转染效率。方法: 抽提外周血单个核细胞的总RNA， 通过RT-巢式PCR方法获得大鼠IL-10的全长编码序列， 定向克隆到真核表达载体pcDNA3.0， 并进行限制性内切酶酶切及测序鉴定。将重组质粒分别通过脂质体TransfastTM与去唾液酸糖蛋白受体介导的脂质体PEIjet-gal转入大鼠肝细胞系BRL， 通过RT-PCR方法检测IL-10 mRNA的表达， 比较二者的转染效率， 用ELISA法检测后者分泌型IL-10的表达。结果: 经酶切及测序鉴定证实， 重组质粒插入片段与大鼠IL-10的全长编码序列完全相符。发现受体介导的脂质体PEIjet-gal转染效率明显高于非受体介导的脂质体TransfastTM 。通过受体介导的脂质体转染， BRL细胞获得高水平的IL-10表达。结论: 成功地构建pcDNA3.0-IL-10重组质粒。受体介导的脂质体对肝细胞有较高的转染活性， 可能成为IL-10基因治疗肝纤维化的有效转染载体。

【关键词】 白细胞介素-10 基因治疗 去唾液酸糖蛋白受体 肝细胞

［Abstract］ AIM: To construct eukaryotic expression vector of rat IL-10 gene and observe its expression in hepatocyte cell line BRL. METHODS: Total RNA was extracted from rat peripheral blood mononuclear cells. The full length coding region of IL-10 was amplified by RT- nested PCR and cloned into eukaryotic expression vector pcDNA3.0. The recombinant plasmid was transfected into BRL cells with either liposome TransfastTM or asialoglycoprotein receptor mediated liposome PEIjet-gal respectively. The expression of IL-10 mRNA was detected with PCR and that of IL-10 secreted from BRL cells transfected by liposome PEIjet-gal was detected with ELISA. RESULTS: The recombinant plasmid was identified and confirmed with digestion of restriction endonuclease and DNA sequencing. Receptor mediated liposome PEIjet-gal exhibited significantly higher transfection efficiency than liposome TransfastTM and higher level secretory IL-10 expressed in BRL cells. CONCLUSION: The eukaryotic expression vector of IL-10 gene was successfully constructed. Asialoglycoprotein receptor-mediated liposome had high transfection efficiency on hepatocytes， suggesting that it could be a potential hepatocyte-targeting delivery system for IL-10 gene therepy.

［Keywords］interleukin-10; gene therapy; asialoglycoprotein receptor; hepatocyte

肝纤维化是多种慢性肝病发展为肝硬化的共同病理过程。白细胞介素-10（IL-10）是一种具多效性的细胞因子， 在肝纤维化的进程中扮演重要的负反馈角色［1］。引入外源性IL-10也被证实对肝纤维化有拮抗作用［2］。但是由于重组IL-10半衰期很短， 难以在体内维持一个相对稳定的浓度; 静脉用药， 其作用缺乏肝脏靶向性。而探讨通过合适途径进行IL-10的基因治疗， 则有可能解决上述问题， 具有一定的应用前景。本实验中构建大鼠IL-10基因的真核表达载体， 并通过受体介导的脂质体和非受体介导的脂质体转染大鼠肝细胞系BRL， 观察IL-10的表达情况， 比较2种有无受体介导的脂质体的转染效率， 为下一步IL-10基因治疗肝纤维化的动物实验奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 材料 真核表达载体pcDNA3.0由福建省消化研究室保存; 逆转录酶购自Fermentas公司; 高保真Taq酶、 限制性内切酶Hind Ⅲ、 BamHⅠ及T4连接酶均购自Promega公司; 质粒抽提试剂盒购自Qiagen公司; 胶回收试剂盒购自上海中科开瑞生物芯片科技有限公司; PEIjet-gal转染载体购自polyplus公司; TransfastTM脂质体购自Promega公司， RNA抽提试剂盒购自Gentra公司; 大鼠IL-10 ELISA试剂盒购自Biosource公司; BRL是永生化的正常大鼠肝细胞系引自中国科学院上海细胞库。

1.2 方法

1.2.1 大鼠IL-10基因的获取 取SD大鼠外周血5 mL， 以Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞， 用RNA抽提试剂盒按说明书抽提总RNA， 并逆转录为cDNA作为模板， 设计两对引物， 用巢式PCR方法扩增出IL-10的全长编码序列（包括信号肽与功能肽）。外侧引物分别位于IL-10编码序列两端的外侧， 其扩增产物将作为内侧引物的模板; 而内侧引物恰位于编码序列两端， 并引入Hind Ⅲ和BamH Ⅰ酶切位点和Kozak序列。外侧引物序列: 上游5′-cgcagccttgcagaaaacagagc-3′， 下游5′-gctctatttatgtcctgcagtccag-3′， 产物片段为606 bp; 内侧引物序列: 上游5′-cgaagcttgccaccatgcttggctcagcac-3′， 下游5′-cgtctagatcaatttttcattttgagtg-3′， 产物片段为559 bp。后者扩增产物在琼脂糖凝胶上电泳， 切下目的片段， 用胶回收试剂盒提取目的DNA。

1.2.2 IL-10-pcDNA3.0重组质粒的构建与鉴定 上述目的片段与pcDNA3.0空质粒均用Hind Ⅲ和BamHⅠ酶进行双酶切，酶切条件为: 总体系20 μL， 含10×酶切缓冲液2 μL， BSA 2 μg， DNA 1 μg， Hind Ⅲ 5 U， BamHⅠ 5 U， 37℃ 4 h。酶切产物各自在琼脂糖凝胶上电泳， 用胶回收试剂盒提取较长片段。目的基因和质粒的回收片段按浓度比3∶1混合， 加入T4连接酶， 4℃过夜。以连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α， 并接种于氨苄青霉素阳性培养液。24 h后用接种针挑取部分菌落作为模板， 用IL-10内侧引物进行菌落PCR， 对扩增出IL-10的菌落之一进行增菌培养， 用质粒回收试剂盒按说明书抽提质粒， 用Hind Ⅲ和BamHⅠ双酶切， 在琼脂糖凝胶上电泳鉴定。并将重组质粒送测序鉴定（委托Invitrogen公司进行）。

1.2.3 PEIjet-gal脂质体与TransfastTM脂质体对BRL细胞转染效率的比较 转染前24 h调整细胞数， 将BRL细胞接种于6孔板中， 使转染时细胞铺满孔底的50%~60%。分别用 PEIjet-gal脂质体与TransfastTM脂质体将重组质粒转染BRL细胞24 h， 并于转染结束即时及之后1、 2、 4、 8、 12、 16 d用RNA抽提试剂盒抽提各组细胞的总RNA， 用RT-PCR方法检测IL-10的mRNA表达， 设立β-actin为内参照， IL-10引物为上述的内侧引物， β-actin引物序列: 上游5′-ccaaccgtgaaaagatgacc-3′， 下游5′-caggaggagcaatgatcttg-3′， 产物片段为660 bp。扩增产物在琼脂糖凝胶上电泳， 凝胶成像系统下观察。

1.2.4 重组质粒转染BRL细胞及分泌型IL-10的表达 转染前24 h调整细胞数， 将BRL细胞接种于6孔板中， 使转染时细胞铺满孔底的50%~60%， 更换2 mL含有100 mL/L小牛血清的DMEM培养液备用。按PEIjet-gal转染体系说明书， 将重组质粒和pcDNA3.0空质粒分别转染BRL细胞， 每组3孔， 24 h后弃上清， 换2 mL含有100 mL/L小牛血清的DMEM培养液。之后每24 h收集上清， 并换2 mL新鲜培养液。取转染后1、 2、 4、 8、 12、 16、 20、 24 d的上清， 用ratIL-10 ELISA试剂盒检测上清中IL-10的含量， 并绘制表达曲线。

2 结果

2.1 大鼠IL-10基因的获取 以IL-10外侧引物扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳， 未见明显片段。但以此扩增产物为模板， 用IL-10内侧引物进行扩增， 并在琼脂糖凝胶上电泳， 在紫外透射仪下见大约559 bp处出现一DNA片段。

2.2 IL-10-pcDNA3.0重组质粒的构建与鉴定 重组质粒用Hind Ⅲ和BamHⅠ双酶切后， 产物进行琼脂糖凝胶电泳， 显示有1条与目的基因Mr一致的DNA片段（图1）。测序结果在BLAST上比对显示， 插入片段序列与大鼠IL-10的编码序列完全一致。

图1 重组质粒pcDNA3.0-IL-10的酶切鉴定（略）

Fig 1 Restriction endonuclease digestion analysis of the recombinant plasmid pcDNA3.0-IL-10

1: pcDNA3.0-IL-10-plasmid digested by Hind Ⅲ/BamH Ⅰ; M1: 100 bp DNA marker; M2: λ-Hind Ⅲ DNA marker; 2: pcDNA3.0-IL-10 plasmid.

2.3 PEIjet-gal脂质体与TransfastTM脂质体转染效率的比较 TransfastTM脂质体组IL-10 mRNA表达较低， 在转染后2 d达到高峰（表达量仍低于β-actin）， 而后迅速下降， 第8天表达消失。而PEIjet-gal脂质体组IL-10 mRNA表达明显高于β-actin， 在转染结束即达高峰， 持续高水平表达至16 d后才开始下降， 到转染后20 d仍有较高表达（图2）。

图2 使用不同脂质体转染后BRL细胞中IL-10 mRNA的表达（略）

Fig 2 Expression of IL-10 mRNA in BRL cells transfected by different liposome

A: Transfect by liposome transfastTM; B: Transfect by liposome PEIjet-gal; M: DNA markers; 0， 1， 2， 4-16: 0， 1， 2， 4-16 days post transfection.

2.4 重组质粒转染后分泌型IL-10的表达 转染pcDNA3.0空质粒者几乎测不到IL-10的表达; 转染重组质粒者可检测到高浓度的分泌型IL-10的表达， 在转染结束后第2天达到高峰（12.78 μg/L）， 第4天即迅速下降， 第8天后保持长时间的低水平表达， 其表达曲线见（图3）。

图3 分泌型IL-10的表达（略）

Fig 3 Expression of secretory IL-10

3 讨论

IL-10是肝纤维化的重要拮抗因子。但是， IL-10在体内R半衰期仅数小时， 为了维持血药浓度， 需多次注射， 且费用昂贵。另外， 静脉注射IL-10作用缺乏靶向性。如果能将IL-10基因转移到合适的靶细胞内， 使其在肝脏较稳定的表达， 就可能解决上述问题。

肝纤维化的形成机制十分复杂， 有多种细胞参与其中， 除了起决定性作用的肝星状细胞（HSC）外， 还有肝细胞、 Kupffer细胞、 窦内皮细胞等［3］。我们认为肝细胞作为基因转移的靶细胞较为合适，基于以下几点考虑: (1)肝脏中， 肝细胞在数量上占绝对优势， 将其作为靶细胞， 可以保证目的基因在肝脏中的高表达; (2)肝细胞膜表面有一种特异性的去唾液酸糖蛋白受体， 为提高基因转移的靶向性提供可能［4， 5］; (3)肝细胞在解剖上与HSC毗邻， 在后者的激活与肝纤维化的进程中起着举足轻重的作用; (4)本实验室以往的研究显示， IL-10对肝纤维化动物模型及在体的HSC作用非常显著， 而单纯将IL-10直接作用于体外培养的HSC， 却影响甚微［6-8］。这提示IL-10对HSC的作用是一个多细胞、 多因子参与的过程， 而肝细胞可能在其中扮演重要角色。

基因治疗中， 载体和转染途径的选择至关重要。病毒载体普遍存在生物安全性问题; 另外， 目前比较常用的腺病毒载体虽然转染效率高， 但会引起强烈的免疫反应， 大大降低再次转染的效率。脂质体作为载体不存在上述问题， 但转染效率低。肝细胞膜上有高密度的去唾液酸糖蛋白受体， 可与半乳糖特异性结合。目前， 许多研究利用这一特性， 进行肝靶向药物递送或基因递送， 取得了很好的效果［9， 10］。jetPEITM-Gal转染体系是在阳离子脂质体上结合半乳糖， 使对肝细胞的靶向性和转染效率都大大提高。

我们通过巢式PCR方法扩增了在体内微量表达的IL-10基因， 成功构建了pcDNA3.0-IL-10重组质粒， 并转染体外培养的大鼠肝细胞系BRL， 获得了高水平的分泌型IL-10的表达。同时发现受体介导的脂质体可大大提高对肝细胞的转染效率， 延长IL-10基因的表达时间。为今后的动物体内实验奠定了基础。另外， 还发现转染后第4天开始出现IL-10 mRNA与蛋白表达的分离现象， 提示在后期存在翻译水平的抑制。这种抑制是否由于后期体外培养的细胞密度过高所致， 尚不得而知。动物体内实验是否也会出现这种分离现象， 有待进一步研究。

参考文献

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［2］ Nelson DR， Lauwers GY， Lau JY， et al. IL-10 treatment reduces fibrosis in patients with chronic hepatitis C: a pilot trial of interferon nonresponders［J］. Gastroenterology， 2000， 118(4): 655-660.

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［6］ Wang XZ， Zhang LJ， Li D， et al. Effects of transmitters and interleukin-10 on rat hepatic fibrosis induced by CCl4［J］. World J Gastroenterol， 2003， 9(3): 539-543.

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［8］ 陈运新， 王小众， 翁山耕， 等. 白细胞介素10对肝星状细胞增殖及表达Fas/Fas配体的影响［J］. 中华肝脏病杂志， 2003， 11(6): 637-640.

［9］ Di Stefano G， Derenzini M ， Kratz F， et al. Liver-targeted doxorubicin: effects on rat regenerating hepatocytes［J］. Liver Int， 2004， 24(3): 246-252.

真核细胞篇7

【摘要】 目的 构建同时表达具有抗原表位FLAG标记的骨形态发生蛋白2(BMP2)目的蛋白和报告分子绿色荧光蛋白(GFP)的新型腺病毒真核细胞表达载体。方法 将去除翻译终止密码子并添加新的酶切识别位点XhoⅠ的BMP2基因定向连入腺病毒穿梭质粒pShuttle CMV-IRES-hrGFP-1。携带BMP2+基因的重组腺病毒穿梭质粒经酶切鉴定、PmeⅠ酶切线性化后转化BJ5183-AD-1大肠杆菌，利用细菌内同源重组机制将BMP2+和GFP基因连同其顺势表达元件重组入腺病毒基因组质粒。用PacⅠ酶切去除其质粒成分，暴露腺病毒基因组的反向末端重复序列，转染293细胞，进行腺病毒的包装，完成新型腺病毒载体Ad CMV-BMP2+-IRES-GFP-1的构建。作为阳性对照，同时制备多年来广为应用的 BMP2腺病毒表达载体Ad CMV-BMP2。以两种载体感染骨髓基质细胞，通过RT-PCR和荧光显微镜分别检测骨形态发生蛋白2和绿色荧光蛋白表达情况;通过碱性磷酸酶活性检测判断BMP2诱导成骨分化作用 。结果 突变后骨形态发生蛋白2基因序列、重组腺病毒穿梭质粒和重组腺病毒质粒酶切图谱符合预定设计。感染骨髓基质细胞后，新型腺病毒载体可同时表达报告分子GFP和具有诱导成骨分化活性的BMP2。结论 成功构建表达BMP2的新型腺病毒载体。

【关键词】 骨形态发生蛋白2基因;绿色荧光蛋白;腺病毒载体;同源重组;成骨诱导

Abstract: Objective To construct a novel recombinant adenovirus vector expressing the BMP2 fused to FLAG epitope and green fluorescent protein(GFP) as a reporter on the same transcript. Methods The basic pairs of BMP2 behind the translation stopping codon TAG were removed and a XhoⅠrestriction site was added following the end of the mutant. Then， the mutant of BMP2 gene (BMP2+ gene)was ligated into the multiple cloning sites of the adenovirus shuttle plasmid pShuttle CMV-IRES-hrGFP-1 by means of the directional cloning technology. Once tested by restriction digestion， the shuttle plasmid was linearized with Pme I and transformed into BJ5183-AD-1 cells to recombine the genes of BMP2+ and GFP together with their cis-acting elements into adenoviral plasmid through a new simplified bacterial homologous recombinant method. To expose its inversted terminal repeats， the recombinant adenoviral plasmids were digested with PacⅠ， and were then used to 293 transfected cells to generate the desired recombinant adenoviruses， Ad CMV-BMP2+-IRES-GFP-1. After the resultant viruses infected the bone marrow stromal cells (MSCs)， the expression of BMP-2 gene was verified by RT-PCR， the osteoinduction activity of the expressed BMP2 was confirmed by alkaline phosphatase activity assay， and the expression of GFP gene was tested through fluorescence microscope. As a positive contrast， another recombinant adenovirus， AdCMV-BMP2， which has been used extensively since many years ago， was also constructed.Results Either the sequence of BMP2 gene mutant or the restriction maps of the recombinant adenoviral shuttle plasmids and the recombinant adenoviral plasmids accorded with experimental project beforehand. The new recombinant adenovirus vectors could express both the gene of BMP2 and GFP at the same time. The expressed BMP2 had osteoinduction activity. Conclusions A novel recombinant adenovirus vector expressing the BMP2 fused to FLAG epitope and green fluorescent protein as a reporter on the same transcript were successfully constructed.

Key words: bone morphogenetic protein 2 (BMP2) gene; green fluorescent protein (GFP); adenovirus vector; homologous recombination; osteoinduction

重组腺病毒在基因治疗中被作为一种高效基因转移和表达载体，广泛用于将外源基因导入哺乳动物细胞[1]。骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2 ，BMP-2)是一种重要的成骨诱导分化细胞因子，可诱导具有成骨分化潜能的间充质细胞向成骨细胞分化，在骨的发生、发育、修复和再生过程中发挥十分关键的作用。BMP-2转基因诱导成骨可实现一定时间内的BMP-2持续表达，近十年来受到广泛关注。迄今为止，病毒型和非病毒型BMP-2表达载体都已被用于BMP-2基因转移诱导成骨研究，其中BMP-2腺病毒表达载体(BMP2-expressing recombinant adenoviral vector，Adv-BMP2)介导的BMP-2转基因方法被认为是其中最有效的手段[2]。为了方便基因的表达检测，我们利用了一种新型的腺病毒载体构建系统，使BMP2基因和绿色荧光蛋白(GFP)基因同时表达，并且通过对BMP2基因的突变，将FLAG抗原标记附加于BMP2，构建了一种新型的BMP2腺病毒表达载体。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

限制性内切酶:NotⅠ、XbaⅠ、XhoⅠ;高保真DNA聚合酶(TaKaRa PyrobestTMDNA Polymerase);大肠杆菌来源的碱性磷酸酶(Bacterial Alkaline phosphatases ，BAP);dNTP;T4DNA连接酶(T4DNA Ligase);DNA凝胶回收试剂盒;RT-PCR试剂盒和DNA Marker：DL1500、DL2000、λHandⅢdigest等购于宝生物工程(大连)有限公司。限制性内切酶PmeⅠ、Pac I购于纽英伦(北京)生物技术有限公司。PCR提纯试剂盒(PCR Purification Kit)， 磷酸钙转染试剂盒(MBS Mammalian Transfection Kit)为美国Stratagene公司产品。超纯质粒提纯试剂盒(MobiusTM 1000 Plasmid Kit )为德国Novagene公司产品。ALP检测试剂盒(Alkaline/Acid Phosphatase Assay Kit)购于美国upstate公司。

1.2 质粒和菌株

pcDNA3-BMP2由第四军医大学生化教研室蒲勤教授提供，BMP2基因cDNA位于多克隆位点NotⅠ、XhoⅠ位点之间，后者在基因连入过程中已经被破坏。

pcDNA3-BMP2+(BMP2+代表携带去除翻译终止密码子并添加新的酶切识别位点XhoⅠ的BMP2基因)、腺病毒穿梭质粒pShuttle CMV- BMP2+-IRES-hrGFP-1及pShuttle CMV- BMP2均由我们自己构建和保存[3]。

BJ5183-AD-1大肠杆菌为Stratagene公司产品。

1.3 细胞及细胞系

人胚肾293细胞系为American Type Culture Collection( ATCC)产品。

骨髓基质细胞由本院外科实验室培养、保存。

1.4 细菌内同源重组构建腺病毒质粒

将含有pShuttle CMV-BMP2+-IRES-hrGFP-1质粒和pShuttle CMV-BMP2质粒的菌株分别化线接种于LB-Kanamycin Agar，37 ℃倒置培养过夜;次日挑选单克隆，分别接种于10 mL LB-Kanamycin Broth，37 ℃、剧烈振荡、过夜培养;第二日上午用碱裂解法抽提质粒抽提质粒， Pme Ⅰ酶切，1%琼脂糖凝胶电泳验证，确保穿梭质粒已经被Pme Ⅰ酶切线性化。乙醇精制以上酶切反应体系，重新溶解于ddH2O中，使终浓度为50～100 ng /μL，备用。电穿孔仪设置在200 Ω， 2.5 KV， 25 μF条件下。冰上预冷0.2 cm gap电击杯、电击池和2只微量离心管。冰上解冻BJ5183-AD-1电感受态细胞。于2只微量离心管中各加入40 μL电感受态细胞胞，分别加入1 μL Pme Ⅰ酶切线性化的pShuttle CMV-BMP2+-IRES-hrGFP-1和pShuttle CMV-BMP2，混合均匀后加入2支0.2 cm gap电击杯。将电击杯置于电击池内，送入电穿孔仪分别电击。电击后迅速向每只电击杯中加入500 μL的LB-Broth，吸打混均，接种于LB-Kanamycin Agar，37 ℃倒置培养过夜。次日挑选10个单克隆，分别接种于10 mL LB-Kanamycin Broth，37 ℃、剧烈振荡、过夜培养。取5 mL过夜培养物抽提质粒， Pac Ⅰ酶切，在0.8%琼脂糖凝胶上电泳鉴定，筛选重组成功的阳性克隆。剩余的4mL置于4 ℃冰箱保存。将保存的4 mL阳性细菌克隆液体培养物接种于250 mL LB-Kanamycin Broth，大量扩增、用超纯质粒提纯试剂盒抽提pAd CMV- BMP2+-IRES-hrGFP-1和 pAd CMV-BMP2。

1.5 腺病毒载体包装

PacⅠ酶切pAd CMV- BMP2+-IRES-hrGFP-1和 pAd CMV-BMP20.8%琼脂糖凝胶电泳验证，确保酶切完全后，以PCR反应提纯试剂盒精致酶切反应液，以去除酶和缓冲液，并将DNA(腺病毒基因组)重溶于灭菌ddH2O ，使终浓度为5 μg/225 μL ，-20℃保存备用。

常规复苏和传代培养293细胞，转染前24 h在2支直径6 cm培养皿内分别植入(7～8) × 105细胞，加 4 mL含10胎牛血清的DMEM培养基，在37 ℃，5% CO2 条件下过夜培养至70%汇合。

以5 μg DNA/只培养皿比例，将上述制备的两种腺病毒基因组DNA及转染试剂按照商家说明分别加入细胞培养皿中，37 ℃，5% CO2温育10 h，用磷酸钙法将腺病毒基因组DNA转染于293细胞。继续培养7～10日，必要时换液，待出现明显细胞病变现象后收集细胞，反复冻-融三次裂解细胞，离心收集病毒并测定病毒滴度，完成腺病毒载体的包装。

1.6 BMP2和GFP表达检测

将MSC细胞以5×105/孔的密度接种于6孔板，常规培养24 h细胞贴壁后，吸弃上清。随机选取2 孔感染腺病毒Ad-CMV - BMP2+-IRES-hrGFP-1 ，另取2 孔感染Ad CMV-BMP2作为阳性对照，感染复数(MOI)均为50，留下2孔作为阴性对照。37 ℃ 孵育1 h，换成DMEM+10%胎牛血清培养基，在体积分数为5%CO2、37 ℃饱和湿度条件下继续培养72 h，荧光显微镜下检测GFP，然后按商家产品说明，用RNA提纯试剂盒抽提细胞总mRNA。置于-80 ℃冰箱保存待用。

取3 种RNA 各约80 ng加入3 支反应管内，以8.5 μL去RNA酶ddH2O稀释，75 ℃变性5 min，冰上冷却。按商家说明建立反应体系，反转录BMP2基因cDNA第一链。反应结束后冰上冷却5 min备用。

设计合成BMP2基因cDNA特异引物： 5′-CGTGACTCTGTCTTCTAG-′3 ;5/-GCACACTCGAGGCGACAC-′3。PCR扩增BMP2 cDNA，取10 μL在以1%琼脂糖凝胶电泳检测。BMP2基因在三组细胞内的mRNA 表达情况。

1.7 碱性磷酸酶活性检测

将第二代MSC细胞以1×103/孔的密度接种于96 孔板，在完全培养基内， 5%CO2、37 ℃、饱和湿度条件下培养24 h。随机选取32孔作为实验组(感染腺病毒Ad-CMV - BMP2+-IRES-hrGFP-1， MOI=50);另选32孔作为阳性对照组(感染Ad CMV-BMP2， MOI=50);其余32孔作为阴性对照组(不予感染腺病毒载体)。37 ℃ 孵育1 h，小心吸除个孔内的液体，用PBS清洗实验组和阳性对照组各孔两次，然后用完全培养基继续在5%CO2、37℃、饱和湿度条件下培养各组细胞。分别于感染载体后第6、8、10、12日收集各组细胞，每次各组均收集8孔，调整各孔细胞浓度为1×105cells/mL，各取1 mL用于ALP活性检测。绘制ALP活性曲线;对三组细胞6、8、10、12日4个时间点的ALP活性采用发样本均数两两比较q检验，进行统计学分析，以P

1.8 采用重复测量的方差分析。

2 结 果

2.1 腺病毒质粒的构建 见图1、2。

2.2 ALP活性检测结果 见表1。表1 不同时间3 组细胞间ALP活性比较注：三组比较F值=4.32，P

3 讨 论

3.1 新型BMP2腺病毒载体的构建

细菌内同源重组法是一种高效构建腺病毒载体的方法[4]，这种方法首先需要构建带有目的基因的腺病毒穿梭质粒，然后将其与腺病毒骨架质粒共转BJ5183大肠杆菌，通过细菌内同源重组机制将目的基因及其在真核细胞中表达所必需的顺势表达元件插入腺病毒基因组。pShuttle CMV -IRES-hrGFP-1是美国Stratagene公司开发的一种新型腺病毒穿梭质粒，具有CMV启动子、多克隆位点和PolyA信号区等真核基因表达所必需的顺势调控元件和同源重组序列。并且在多克隆位点后依次设计安排了FLAG抗原表位(FLAG epitope， FLAG为人工合成抗原表位，其氨基酸残基序列为DYKDDDDK)基因、内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site ，IRES)和GFP基因。由于IRES的存在，使插入多克隆位点的目的基因能与GFP基因以双顺反子的形式同时表达。双基因表达载体是载体构建新的发展方向，以双顺反子形式表达GFP报告基因和BMP2目的基因，同时能够对BMP2进行抗原表位标记的腺病毒表达载体可极大的方便BMP2蛋白表达检测，目前尚未见报道，是一种新的尝试。

实验通过PCR技术突变去除pcDNA3-BMP2所携带的BMP2基因序列中翻译终止密码子后的碱基序列，在其后添加XhoⅠ位点。添加XhoⅠ位点后使基因能够定向连接于pShuttle CMV -IRES-hrGFP-1多克隆位点中的NotⅠ和XhoⅠ之间。去除翻译终止密码子之后碱基的BMP2基因序列从翻译起始密码子到FLAG抗原表位基因的碱基序列长度为1194bp，不会导致FLAG抗原表位基因的框移突变，而且由于去除了BMP2基因的终止密码子，导致两个基因的通读，使两种蛋白融合表达。重组腺病毒穿梭载体制备成功后，利用BJ5183细菌内的同源重组机制，构建了腺病毒质粒Ad CMV-BMP2+-IRES-rhGFP-1和Ad CMV-BMP2。PacⅠ酶切图谱表明在不同BJ5183重组阳性克隆内，由于穿梭质粒和腺病毒质粒均存在DNA原核复制起点Ori序列，重组成功的腺病毒质粒经PacⅠ酶切后应该产生一个大于23kb的DNA 片段和约3.0kb或4.5kb的小片段两种均可以接受的情况。在已经鉴定的Ad CMV-BMP2+-IRES-rhGFP-1阳性克隆中，这两种情况均已出现。而已鉴定的Ad CMV-BMP2阳性克隆， PacⅠ酶切仅产生23kb和3.0kb两种长度的DNA酶切片段(图1、图2)。

实验中采用了先进的细菌内同源重组法来构建腺病毒载体，从而大大节省了时间与费用。与目前普遍采用的哺乳动物细胞内同源重组法相比，这种方法具有简便、快捷、经济和高效等优势。前者在293等包装细胞内进行同源重组，细胞的状态对重组效率影响很大，通常要求传代次数不得超过45代，因此有时不得不重复引进代数较低的293细胞;另外，293细胞既是同源重组的场所，又是病毒的包装的场所，包装后的病毒需要经过反复的筛选、鉴定和纯化[5]。后者是对细菌操作，其培养、转化和重组克隆的筛选远较细胞方便、快捷和经济，技术也较成熟，从质粒转化到重组克隆的出现仅需12～20 h，加上筛选的时间也不过36 h;最重要的是，重组DNA(腺病毒质粒)经鉴定后在293细胞内包装，不需要再对病毒进行筛选和鉴定，病毒滴度和纯度都较高。

3.2 新型BMP2腺病毒载体的表达分析

为了检测所构建的新型载体表达GFP和BMP2情况，进一步将其和阳性对照载体分别转染骨髓基质细胞(MSCs)，同时用未转染载体的MSCs作阴性对照。转染3天后，首先在荧光显微镜下对活细胞进行观测，结果显示感染新型载体的细胞表达GFP(图3)。然后分别收集裂解三种细胞，提取其RNA，设计合成BMP2基因特异的正、反向引物，进行RT-PCR检测。PCR产物电泳结果显示，从转染两种重组腺病毒载体的MSCs中，均扩增出长度一致的DNA片段，这一长度符合预期设计(两引物间跨度为1190bp)，而阴性对照没有扩增出任何DNA片段，从而在mRNA水平上证实了载体表达BMP2基因的可行性(图4)。为了进一步验证载体表达产物(BMP2)的成骨诱导效应和初步了解其时间动力学规律，实验中对MSCs感染载体前后的ALP活性进行了检验，并选用感染后6、8、10、12日几个时间点对其进行了连续观测。ALP是成熟成骨细胞具有代表性的标志酶，具有水解有机磷酸物质，提高局部磷酸根浓度和水解破坏钙化抑制剂等重要功能，在体内外钙化过程中发挥关键作用，ALP升高是MSCs向成骨细胞转化的灵敏指标[6]。感染后第6日检测结果经统计学分析显示，新型载体和阳性对照载体均可以显著提高MSCs的ALP活性水平(P< 0.01)，两种载体效应差异无显著统计学意义(P>0.05)，因而在表达产物的生物学行为层次上也证明了新型载体表达BMP2基因的可行性(表1)。以连续观测结果绘制的曲线图(图5)显示，细胞感染载体后8日内ALP活性升高幅度较大，说明载体表达BMP2量或其生物活性是十分高的，短期内即可发挥明显的生物学效应;10天后上升速度明显减慢，曲线趋于平缓，ALP活性维持在一个较高水平，这可能与此时细胞生长、分化或BMP2作用已经接近饱和有关，实验中我们观察到，此时细胞生长已经铺满培养板各孔底部。从曲线图中还可以看到，MSCs本身有一定的基础表达，但水平较低，曲线基本上呈一条平滑的基线，这是因为实验所应用的MSCs是基于骨髓基质干细胞的帖壁特点获得的，并非单一的细胞类型，其中包含有少量具有分泌ALP能力的细胞类型，如成骨细胞和确定性成骨祖细胞(DOPC)等。

实验所构建的BMP2腺病毒表达载体与以往的BMP2腺病毒载体不同，它可以同时表达具有抗原表位标记的目的蛋白BMP2和报告分子GFP，这使新载体比原有载体具有很大的优势。首先，引入报告分子GFP使检测活细胞BMP2表达成为可能。因此，一方面可以即时监测表达情况;另一方面，细胞经检测后仍然可以用于后续实验[7]。其次，引入FLAG抗原标记增加了对目的基因的检测手段，这在缺乏目的基因特异性单克隆抗体的情况下尤为重要[8]。

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真核细胞篇8

【关键词】 肺癌; 基因治疗; 生存素; 启动子; 单纯疱疹病毒1型胸苷激酶

[Abstract] Objective: To construct a lung cancer specific the herpes simplex virus 1 thymidine kinase (HSV1TK) expression vector regulated by survivin promoter (SURV) and detect its activation and potential to inhibit the grow of lung cancer in vivo. Methods: Plasmid pGL3TK was obtained by substituting the luciferase cassette with a PCR product corresponding to TK with flanking Nco Ⅰ and Xho Ⅰ sites. To obtain the pSURVTK and pCMVTK two versions， the SURV and CMV cassettes were excised with Bgl Ⅱ and Hand Ⅲ and cloned into the respective sites of the vector. Recombinant plasmid pSURVTK and pCMVTK were transfected into survivin positive or negative cell lines by the means of lipofectamine. The expression of HSV1TK was tested by Western Blotting， Ganciclovir cytotoxicity assay to evaluate the activation of SURV and in vivo tumorigenesis experiments to explore the potential using this vector to treat lung cancer. Results: The vector pSURVTK has been successfully constructed which can not only express the TK protein indentified by Western Blotting， but also show its enzyme activation related to the concentration of ganciclovir and suppression of tumor growth in vivo. Conclusion: Survivin promoter can effectively drive the HSV1TK to express. The expression of TK gene will be confined just within the site of tumor. This presented a new way of employment sucide genes for treatment of lung cancer.

[Key words] lung cancer; gene therapy; survivin; promoter; herpes simplex virus 1 thymidine kinase

肺癌已成为恶性肿瘤死亡的首要病因，传统的治疗方法包括化疗、放疗和手术，总的生存率不到15 %[1]。随着免疫学和分子生物学的飞速发展，肺癌的基因治疗越来越受到研究人员的重视。采用非病毒载体携带治疗基因，如自杀基因单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(HSV1TK)基因是目前肺癌基因治疗的研究热点之一。这些非病毒载体一般使用真核细胞启动子如巨细胞病毒启动子(CMV promoter)，该启动子无组织特异性，在正常细胞中也能高表达TK基因，通过使无毒的前药如更昔洛韦(GCV)转化成有毒的磷酸化产物，对正常组织也会造成损伤[2，3]。所以，研究在肺癌细胞高表达，而在正常组织低表达，甚至不表达的特异性启动子是肺癌自杀基因治疗成功的关键。

生存素(survivin)是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins， IAP)家族的新成员，其组织分布特征具有明显的细胞选择性，在胚胎及多种肿瘤细胞系中高表达，但是不表达于终末分化的正常组织[4-6]。Survivin主要通过转录水平调控mRNA或蛋白的表达[7-8]。

本研究构建了生存素基因启动子(survivin promoter)调控的HSV1TK基因表达载体，通过体内外对肺癌细胞的杀伤效应研究，证实生存素启动子在肺癌细胞中特异性活化，可以驱动其调控的下游TK基因的表达，在更昔洛韦(Ganciclovir，GCV)的作用下，可有效抑制肺癌细胞的生长，为应用自杀基因治疗肺癌提供了新思路。

1 材料和方法

1.1 试剂和工具酶

异丙基β半乳糖苷(IPTG)、低分子质量蛋白标准品、核酸标准参照物、限制性内切酶Bgl Ⅱ、Hind Ⅲ、Nco Ⅰ、Xho Ⅰ和Taq DNA聚合酶、T4DNA连接酶、质粒DNA纯化试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、DNA标准参照物(上海华美生物工程公司);蛋白胨、酵母粉、丙烯酰胺等(上海生工生物工程公司);PCR引物均由上海英骏生物技术有限公司合成。脂质体Lipofectamine2000 购于Invitrogen 公司，更昔洛韦购自罗氏公司，兔抗HSV1TK血清由耶鲁大学William C Summers教授馈赠。

1.2 质粒和细胞株、菌株

Survivin基因启动子SURV由美国MD Anderson Cancer Center的MienChie Hung教授馈赠，含有HSV1TK cDNA的质粒rpAs16Dr由德国MartinLuther大学Ariane Sling教授馈赠， pGL3Basic载体购自美国Promega公司，质粒pcDNA3.1(+)、人肺癌细胞株A549、E.coli菌株XL1Blue由本室保存。

1.3 仪 器

凝胶扫描仪、蛋白电泳仪、电转化仪、凝胶扫描仪、AKTA Prime 高压液相色谱仪(以上均为伯乐公司产品)，恒流泵(兰格公司)。

1.4 重组载体pSURVTK、pCMVTK，pSURVLuc、pCMVLuc的构建

根据HSV1TK的DNA序列设计一对引物，在P1和P2的5′ 端引Nco Ⅰ和Xho Ⅰ两个酶切位点，TKP1：5′ATCCATGGATGGCTTCGTACCCCT3′和TKP2：5′ATCTCGAGTCAGTTAGCCTCCCCC3′，将PCR产物亚克隆至用Nco Ⅰ和Xho Ⅰ消化的真核表达质粒pGL3Luc，PCR鉴定阳性重组质粒pGL3TK;Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ酶切pcDNA3.1(+)并回收CMV启动子，与SURV启动子一起克隆至pGL3Luc和pGL3TK的Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ酶切位点间，Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ双酶切鉴定重组载体pSURVTK、pCMVTK，并经DNA测序证实。

1.5 蛋白质印迹法检测转染细胞外源HSV1TK基因表达蛋白

人肺癌细胞系A549及正常人肝细胞LO2均用DMEM培养液于37 ℃、5%CO2条件下培养。转染前1天，取生长良好的细胞，胰酶消化，记数，将细胞浓度调至5×104个/ml，在6孔细胞培养板的每孔加入2 ml含上述细胞的DMEM培养液，每孔细胞数为1×105个。在Lipofectamine 2000的介导下分别转染pSURVTK质粒和pCMVTK质粒。每种质粒转染3个孔，具体按Lipofectamine 2000操作手册进行，待转染的细胞用无血清、无双抗的DMEM培养基洗2次，在每孔中加入混匀的DNA脂质体复合物溶液，细胞在37 ℃继续温育5 h后，吸去转染液，加入2 ml含10%小牛血清的DMEM，继续培养48 h。PBS充分洗涤细胞，100 ℃、10 min将细胞裂解，取15 μl细胞裂解液加15 μl 2×加载缓冲液，100 ℃、10 min，12 000×g离心10 min。取20 μl上清12% SDSPAGE电泳，阴性对照为未转染的A549、LO2细胞裂解物，电转移至硝酸纤维膜，加1∶200稀释的兔抗HSV1TK血清37 ℃轻摇孵育2 h，1×PBST(含0.05% Tween20)洗膜3次，加1∶200稀释的羊抗兔IgGHRP， 37 ℃轻摇孵育2 h，加邻苯二胺显色10 min，水洗终止反应。

1.6 MTT法测定细胞增殖抑制率

在96孔细胞培养板的每孔中加入0.1 ml含上述细胞的DMEM培养液，每孔细胞数为5×104个，用pSURVTK，pSURVLuc质粒DNA 在Lipofectamine 2000的介导下转染细胞，质粒的用量为0.1 μg/孔;脂质体Lipofectamine 2000的用量为0.2 μl/孔。每种质粒转染40个孔。转染48 h后，分别加入终浓度为0，0.01，0.05，0.1，0.5，1，5，10，50，100，150 μmol/L的GCV，其中不加GCV的3孔作为对照组，以上每份样品均设3个复孔。37 ℃继续培养3 d。采用MTT法测定细胞增殖情况。1000 r/min离心5 min，去上清，每孔加入MTT(5 mg/ml)10 μl，继续培养4 h，每孔加入100 μl二甲亚砜(DMSO)混匀，570 nm测D值，根据下列公式计算细胞增殖抑制率(GIR)：GIR(%)=(1-实验组光密度值/对照组光密度值)×100%。

1.7 pSURVTK抗肿瘤实验

将A549细胞悬浮于PBS中，浓度调至1×107个/ml。BALB/c 裸鼠，雌雄不限，4～6周龄，体质量30～60 g，随机分为3组，每组10只。分别于背部皮下注射100 μl细胞。当肿瘤体积达到30 mm3时，瘤内注射pSURVTK、pCMVTK、pCMVLuc 质粒DNA-脂质体复合物(50 μg/次)，每隔1天依次转染，连续7次，转染的第2次各组动物同时尾静脉注射GCV，100 mg /kg，共6次。每隔1天测量1次肿瘤体积，肿瘤体积(V)=A(mm)×B(mm)2/2。A为肿瘤最长直径，B为最短直径。

1.8 数据处理

数据均采用x±s形式表示，利用SAS 8.1软件对各实验组的细胞增殖抑制率与其对照组的差异显著性进行t检验分析。

2 结 果

2.1 真核表达载体pSURVTK、pCMVTK，pSURVLuc、pCMVLuc的构建

将制备好的TK基因PCR片段亚克隆至真核表达载体pGL3Luc中，筛得的阳性菌落经PCR扩增鉴定，经1%琼脂糖凝胶电泳，可见到与TK基因相对分子质量一致的目的基因片段(HSVTK相对分子质量为1144 bp左右)(图1A)，核苷酸序列测定结果表明，克隆基因的核苷酸序列与HSVTK的DNA序列完全一致，说明pGL3TK构建成功;将制备好的SURV、CMV启动子片段分别亚克隆至pGL3-Luc或pGL3TK真核表达载体Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ的酶切位点间，筛得的阳性菌落经Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ双酶切，获得900 bp大小CMV启动子基因(图1B，泳道1)和977 bp大小SURV启动子基因(图1B，泳道2)，经核苷酸序列测定证实，pSURVTK、pCMVTK，pSURVLuc、pCMVLuc构建成功。图1 PCR扩增HSV1TK基因及pSURVTK、pCMVTK重组真核表达载体酶切鉴定

2.2 HSV1TK基因的表达

转染pSURVTK质粒或pCMVTK的质粒A549细胞裂解蛋白能被兔抗HSV1TK阳性血清特异性识别，且识别条带的浓度相近，而转染pSURVLuc质粒或pCMVLuc质粒的A549细胞以及转染pSURVTK transfected LO2细胞裂解蛋白则不能被识别(图2)，说明HSV1TK基因在SURV启动子调控下于肺癌细胞中特异性高效表达。

2.3 TK蛋白的酶活性

对转染pSURVTK质粒的A549细胞进行不同浓度(0.01～500 μmol/L)GCV的细胞毒实验，采用MTT法检测72 h时的细胞杀伤活性。A549细胞的生长呈明显的浓度依赖性，低浓度(0.1 μmol/L)GCV对其的抑制率在第3天达到了41%，且抑制率与GCV浓度及作用时间(数据未列出)呈正相关，而转染pSURVLuc质粒的A549细胞在同样浓度的GCV作用下生长几乎未受影响(图3)。t检验分析表明差异具统计学意义，由此表明SURV启动子调控下的HSV1TK基因仍具有很好的酶活性。

M：蛋白标准参照物;1：转染pSURVTK的A549 细胞;2：转染pCMVTK的A549细胞;3：转染pSURVLuc的 A549 细胞;4：转染pCMVLuc的 A549细胞;5：转染pSURVTK的LO2细胞图2 SURV启动子调控HSV1TK基因表达的蛋白印迹分析　图3 HSV1TK基因表达对肺癌细胞和正常细胞增殖的影响

2.4 HSV1TK基因对体内肿瘤生长的抑制作用

第6天肺癌瘤体长至38 mm3大小，这时3组大鼠分别瘤内注射pSURVTK、pCMVTK、pCMVLuc 质粒DNA脂质体复合物，接着尾静脉应用GCV，20 d后pSURVTK组和pCMVTK组肿瘤大小仅分别为85、83 mm3，而pCMVLuc组(对照载体)大小为180 mm3，P

3 讨 论

自杀基因疗法的最大特征就是具有“旁观者效应”，即只要正常组织有少量目的基因获得表达，就有可能产生严重的副作用[9]。因此，使自杀基因仅在肺癌组织中获得特异性表达，从而准确地杀伤肿箭头处为给药时间点， *：P

图4 体内转染pSURVTK对肿瘤生长的抑制作用瘤细胞，保护正常组织，减少毒副作用，是肺癌采用自杀基因疗法的关键。其中，用肿瘤特异性启动子启动目的基因特异性的表达是目前多数学者关注的方法之一[3]。

研究显示，SURV启动子在肿瘤细胞中具有高活性，正常细胞株和组织中被抑制，尤其是肺组织。SURV启动子在心、肺、脑、肝、肾活性很低，表明当体内应用SURV调控的TK基因载体时，毒副作用可以大大降低[10]。

常用的肿瘤特异性启动子如AFP、hTERT等启动子的活性往往弱于CMV启动子和SV40启动子，SURV启动子也不例外。我们的研究结果显示，虽然SURV在各种肿瘤细胞的活性仅为CMV启动子的10%～40%，已足够抑制肿瘤细胞的生长，一方面表明SVRV启动子在肺癌细胞中也具有很强的启动下游基因转录的活性，另外，特异性表达于肺癌细胞中的TK也产生显著的旁观者效应，极大地弥补了启动子活性低的不足。

我们构建了SURV启动子调控下的HSV1TK基因的真核表达载体pSURVTK，采用蛋白质印迹法证实pSURVTK在肺癌细胞系A549中可表达出TK蛋白，GCV细胞毒实验表明表达的TK蛋白具有酶活性，可有效抑制体内肺癌的生长。

综上所述，SURV启动子可以驱动TK基因在肺癌细胞中的特异性转录，在GCV作用下，体内外能有效杀伤肺癌的生长，为自杀基因治疗肺癌提供了新的途径。

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