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马钱子含药血清的制备与鉴定

[关键词]马前子;含药血清;制备;鉴定

[中图分类号]R285 [文献标识码]B[文章编号]1673-7210(2007)10(a)-087-02

马钱子,始载于《本草纲目》,其味苦性温,有大毒,入肝经,善于活血散结,通络止痛,它具有兴奋中枢、脊神经以及增强横纹肌、平滑肌、心肌的肌力与强筋骨,利关节,通经脉等功效[1]。在临床上常用于痹证、痿证等治疗。笔者发现马钱子在保护软骨上起有一定的药效学作用。为了进一步深入研究马钱子对体外培养的软骨细胞保护作用,本实验着重进行马钱子含药血清的制备与鉴定。

1 材料与方法

1.1试剂及药品

马钱子碱、士的宁购于中国药品生物制品检定所(06-9403)均为20 mg/支;马钱子制剂由河南省中医院中药库提供;苯,上海东懿化学试剂厂(2002201),分析纯;乙酸乙酯,华东师范大学化工厂(19991112),分析纯;二乙胺,中国医药上海化学试剂公司(20020702);硅胶,G薄层板(200 mm×200 mm),青岛海洋化工厂。

1.2动物

新西兰兔4只,体重2.0~2.5 kg左右,由河南省动物实验中心提供。

1.3马钱子含药血清的制备

取健康新西兰兔4只,分成2组,为马钱子药物组和空白对照组,每组2只,体重在2.25 kg左右。马钱子组按马钱子100 mg/kg剂量配成溶液灌胃,空白对照组按2 ml/kg生理盐水配成溶液灌胃,1 次/d,均连续给药3 d,末次灌药2 h后,硫喷妥钠麻醉后,无菌条件下于腹主动脉下取血,离心后,取血清,过滤后,经56℃30 min灭活处理后,备用。试验时用培养液配成20%,10%,5%的含药血清作为马钱子高、中、低剂量的含药血清。

1.4马钱子含药血清中成分使用薄层层析法鉴定

取200 mm×200 mm硅胶G板105℃活化1 h,置干燥器中冷却备用。分别取马钱子含药血清、空白兔血清各5 ml,分别加甲醇50 ml,超声提取0.5 h,分别过滤,滤液蒸干后分别加0.5 ml甲醇溶解,即得含药样本和不含药样本(备点样用)。对照品溶液的配制:取马钱子碱、士的宁对照品各约l mg,分别加甲醇2 ml溶解,得马钱子碱对照品溶液、士的宁对照品溶液各1份(备点样用)。活化的硅胶板取4个点样:马钱子碱对照品、士的宁对照品、马钱子含药血清样品、空白兔血清样品,加入20 ml展开剂为苯、乙酸乙酯、二乙胺(1∶2∶0.05),展距为15 cm,展开后取出,晾干,以稀碘化铋钾试液显色。稀碘化铋钾试液按2000年版药典配制。

2 结果

马钱子含药血清中成分的鉴定结果:马钱子碱对照品原点上方和士的宁对照品原点上方各显现出1个桔黄色斑点(Rf马=0.29;Rf士=0.44),马钱子含药血清原点上方在对照品相应的位置上显现出2个相同的桔黄色斑点,而空白兔血清则无桔黄色斑点显示,这表明马钱子含药血清中含有马钱子碱和士的宁成分。

3 讨论

顽痹的成因,多由风寒湿邪阻滞络脉,日久不解,痰瘀搏结所致。常规药物往往力所不及。中药马钱子药性峻猛,善钻筋透骨,活络搜风,散结止痛,其开通经络、透达关节之功远胜他药。马钱子既有通络止痛作用,又有强筋壮骨功效,能行能补,配伍可寒可热、一药多能[2],是临床治疗骨关节炎之要药。目前中药成方治疗骨关节炎有较好疗效的多含有马钱子,如中成药马钱子散、伤科七味片、益髓冲剂,腰痛宁等。笔者发现马钱子在保护软骨上有一定药效学作用。因此,有必要进一步探讨马钱子对骨关节炎作用机制。为了深入研究马钱子对体外培养的软骨细胞保护作用,本实验着重进行马钱子含药血清的制备,并对血清中成分进行鉴定。

实验中,笔者运用血清药理学的方法观察马钱子的药学作用,即通过给成年新西兰兔灌服一定量马钱子,采用的马钱子为炮制品,毒性已大大降低,马钱子具体剂量参照中华人民共和国卫生部药典委员会主编的《中华人民共和国药典(一部)》[3],药典规定马钱子剂量为0.3~0.6 g/d,笔者在实验中设计马钱子剂量为0.5 g/d,新西兰兔用药剂量根据动物与人体的每千克体重剂量折算。进行代谢后,取其马钱子含药血清,配制成不同浓度,加入软骨细胞体外培养体系中进行试验。因为中药多数是通过口服而起作用的,而用中药粗制剂如马钱子直接加入人离体反应体系中进行实验研究在方法学上存在很多问题。由于中药存在不少杂质成分,各种电解质或鞣质成分,以及不同酸碱度的影响等,都会对其生理活性造成一定的假象,从而影响体外实验结果的正确性。运用血清药理学的研究方法,以含药血清进行体外实验,可以排除以上各种干扰因素的影响,比较接近药物体内环境中产生药理效应的过程;同时,含药血清可以避免体外实验因药物体内代谢过程而得出的错误结论[4]。运用马钱子含药血清培养软骨细胞更接近体内,更能反映出马钱子的作用。目前血清药理学还存在如血清采集时间、含药血清浓度测定等争议。笔者采用较通行的办法,即连续给药3 d,末次给药后2 h采血,2 000 rpm,20 min离心,56℃,30 min灭活[5]。笔者同时对马钱子含药血清中主要成分进行鉴定,目前认为马钱子中主要成分有马钱子碱、士的宁等,笔者根据文献所述方法[6]将马钱子含药血清与对照品马钱子碱和士的宁比较,马钱子含药血清在相应的位置上显现出2个相同的桔黄色斑点,而空白兔血清则无桔黄色斑点显示,这表明马钱子含药血清中含有马钱子碱和士的宁成分,而空白兔血清则无马钱子碱和士的宁成分。通过本实验,笔者对马钱子含药血清定性鉴定作了一些探索,而马钱子含药血清定量测定,则有待于大家今后进一步研究。

[参考文献]

[1]刘青云.中药药理学[MJ.北京:人民卫生出版社,1997.124.

[2]周翠英,孙素年,傅新利.风湿病中西医诊疗学[M].北京:中国中医药出版社,1998.233.

[3]中华人民共和国国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京:化学工业出版社,2000.38.

[4]阴赫宏,李兰芳,金亚宏,等.中药含药血清药理与在体药效相关性的初步观察[J].中国中医药信息杂志,1999,6(10):35.

[5]孟李,王宁生.含药血清的制备方法研究[J].中药新药与临床药理,1999,10(5):290-292.

[6]杨勤建.化痰散结方含药血清诱导人肺癌细胞凋亡的机理研究[J].北京中医药大学学报,1999,22(5):70-72.

(收稿日期:2007-07-26)

中药制剂清肺饮颗粒中绿原酸的含量测定

【摘要】目的建立清肺饮颗粒中绿原酸的含量测定方法。方法采用薄层扫描法。结果绿原酸在024~201 μg范围内线性关系良好。平均回收率为10109%,RSD为169%。结论本方法准确、灵敏、可靠,可有效地用于清肺饮颗粒的质量监控。

【关键词】清肺饮颗粒;绿原酸;薄层扫描法

Determination of chlorogenic acid in Qingfeiyin Keli of Chinese MedicineYANG Zhihua, CHEN Yihua, HONG Meihua Shantou Hospital Of Skin disease prevention and cure,Guangdong Shantou 515041,China

【Abstract】ObjectiveTo establish a method to determine the content of chlorogenic acid in Qingfeiyin Keli MethodsTCLScanning used ResultsA good linear range of chlorogenic acid was shown at the concentration from 024~201 μg The average recovery was 10109% and the RSD was 169% ConclusionThe method was accurate、sensitive and credible,It can be effectually applied to the quality control of chlorogenic acid in Qingfeiyin Keli.

【Key words】Qingfeiyin Keli;Chlorogenic acid;TCLScanning

作者单位:515041广东省汕头市皮肤性病防治院(杨志华);广东省汕头市中医医院(华);广东省汕尾市药品检验所(洪美华)清肺饮颗粒是本医院的自制中药制剂,该处方由黄芩、银花、连翘、紫花地丁、桔梗、枇杷叶等药物组成,具有清热泻火、凉血解毒、消痰止咳的功效。主要用于实热火毒型急性咽喉炎,多见口腔溃烂、口舌生疮;也用于肺、胃热盛型的痤疮,脂溢性皮炎等皮肤病的治疗。本制剂在保持中医用药理论的前提下,结合现代研究成果将其制成疗效可靠、质量稳定、携带服用方便的口服液。该制剂中成分复杂,绿原酸为主要成分之一,为控制制剂的内在质量,根据其所含化学成分及性质,查阅相关文献[1~5],本文采用薄层扫描法测定制剂中绿原酸的含量,为制剂的质量保证奠定了基础。

1仪器与材料

11仪器CS9301PC型双波长薄层色谱扫描仪(带FDU3电脑显示及DR13数据处理机,日本岛津);高效硅胶G薄层板(青岛海洋化工厂,20101015);定量毛细管(美国Drummond Scientific Co);薄层板自动涂布器(重庆贝尔);BP211 d电子分析天平(Sartorius德国)。

12材料清肺饮颗粒及所用药材均由本医院制剂室提供,绿原酸对照品由中国药品生物制品检定所提供;所用试剂均为AR级。

2方法与结果

21薄层层析与扫描条件的选择硅胶G层析板,于105℃活化约1 h,放入干燥器中备用;展开剂:醋酸丁酯甲酸水(14∶5∶5)的上层溶液;λs=325 nm,λR=370 nm。狭缝为12 mm×12 mm;SX=3,灵敏度2;双波长反射锯齿扫描。

22对照品溶液的制备精密称取绿原酸对照品25 mg,加甲醇使溶解,定容至5 ml摇匀,制成对照品溶液。

23供试品溶液的制备量取本口服溶液10 ml,加于D101大孔吸附树脂柱上,用50 ml水洗脱,弃取水洗液,再用20%乙醇30 ml,收集洗脱液,将20%乙醇液蒸干,残渣加甲醇适量溶解并过滤,滤液加甲醇定容至5 ml,制成供试品溶液。

24阴性对照溶液的制备按处方比例,取缺金银花的其他各味药材适量,按制备工艺和供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。

25干扰性试验吸取供试品溶液、阴性对照溶液各2 μl,对照品溶液05 μl,分别点于同一硅胶G层析板上,照上述色谱条件扫描。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,有相同吸收峰,阴性无干扰(结果见图1)。

1~3、供试品;4、绿原酸对照品;5、阴性对照

26线性关系精密吸取对照品溶液05、1、2、3、4 μl,分别点于同一薄层板上,展开,定位,按拟定条件进行测定。以点样量为横坐标,峰面积积分值为纵坐标,得回归方程:Y=2107365X740195,r=09982。结果表明绿原酸点样量在024 μg~206 μg范围内呈现良好的线性关系。

27精密度试验精密吸取同一样品(批号20110309)溶液各05 μl,点于同一硅胶G薄层板上共5个点,同法展开后测定,RSD为319%(n=5)。

28稳定性试验取供试品溶液按上述条件点样,展开,定位,每隔30 min扫描测定1次。结果表明,绿原酸斑点在2 h内稳定,RSD为122%。

29重复性试验取批号20110309的样品6份,分别按含量测定方法测定,平均含量为1691 mg/ml,RSD为252%,表明本方法重现性良好。

210加样回收率试验采用加样回收法,精密吸取已知含量的清肺饮颗粒样品5份,分别加入一定量的绿原酸对照品,按上述方法制备样品溶液。吸取1 μl点样,按上述色谱条件测定绿原酸的含量,结果表明,加样回收率为10109%,RSD=169%。

211样品含量测定分别精密吸取不同批号的清肺饮颗粒各10 ml按供试品溶液制法制备,精密吸取供试品溶液1 μl、对照品溶液05 μl与4 μl分别交叉点于同一硅胶G薄层板上,依法展开测定,共测定样品3次,结果见表1。

表1样品含量测定

项目样品批号201103092011031720110325123123123含量(mg/ml)165617511603182318121776177717991801平均含量(mg/ml)167018041792RSD(%)44140743讨论

31本文章采用薄层扫描法对金银花中绿原酸的含量进行测定,在选择薄层层析条件时进行比较,醋酸丁酯∶甲酸∶水(14∶5∶5)的上层溶液,正丁醇∶冰醋酸∶水(4∶1∶2)和氯仿∶醋酸乙酯∶甲酸(4∶4∶2)。经实验选用醋酸丁酯∶甲酸∶水(14∶5∶5)的上层溶液为展开剂能达到较好分离效果,斑点集中。

32绿原酸含量测定试验中,采用通过大孔树脂排除干扰时,还应注意选用洗脱液乙醇的比例,当分别用水、10%以下浓度的乙醇液洗脱时,除去杂质,不会造成绿原酸损失。选用20%及以上乙醇液经检验含有绿原酸,故选用水及10%乙醇洗脱杂质,收集20%乙醇洗脱液备用。

33本文为了保证制剂的质量,对不同产地的金银花药材中绿原酸的含量进行测定,结果表明不同产地的金银花绿原酸的含量有较大差别,其中河南金银花绿原酸的含量最高,所以本方规定制剂所用金银花应为河南产“蜜银花”。

34金银花为方剂中主药,绿原酸为金银花的主要活性成分,故选择绿原酸作为控制本品质量的指标成分。通过上述研究,建立清肺饮颗粒的质量标准,同时用于清肺饮颗粒的工艺筛选,稳定性试验,以及对原药材的质量控制,为全面控制制剂质量提供了理想的方法。

参考文献

[1]中华人民共和国药典(一部) 中国医药科技出版社,2010.

[2]中华人民共和国卫生部药典委员会部颁标准WS3B280897《中华人民共和国卫生部药品标准》(中药成方制剂第十二册),1997:6.

[3]王天志 金银花中3种有机酸的反相高效液相色谱法定量分析药物分析杂志,2000,20(5):293.

[4]刘祥兰 金银花中绿原酸提取工艺的比较和优化研究中成药,2000,22(6):402.

[5]郑占虎中药现代研究与应用学苑出版社,1997.

甲肿消制剂及其含药血清中哈巴俄苷的含量测定

作者:张秋燕,崔翰明,刘喜明,朱晓芸,白鸽

【摘要】 目的建立甲肿消制剂及灌胃给予甲肿消后大鼠血清中的哈巴俄苷含量测定方法。方法采用rp-hplc法测定哈巴俄苷的含量,色谱柱:kromasil c18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)和easyguard保护柱,以乙腈和1%醋酸溶液为流动相,采用梯度洗脱;流速:1 ml· min-1;检测波长为278 nm;进样量:5 μl。结果哈巴俄苷在1.46~146 μg·ml-1的浓度范围内线性良好;低、中、高浓度哈巴俄苷的精密度(rsd)(n=5)分别为1.05%,0.59%,0.80%;日间差(rsd)(n=5)为1.00%;制剂和大鼠血清中哈巴俄苷的加样回收率(n=5)分别为(98.02±1.01)%和(101.03±1.64)%;测定其重现性(rsd)(n=6)分别为0.73%和0.96%;每克制剂中含哈巴俄苷的量为230.5 μg,每毫升含药血清中哈巴俄苷的量为1.88 μg。结论该方法简便、快速、准确、重现性良好,可用于制剂和血清中哈巴俄苷的含量测定。

【关键词】 哈巴俄苷; 甲肿消制剂; 固相萃取; 反相高效液相色谱

chinaabstract:objectiveto develop a determination method of harpagoside in jia zhong xiao preparation and blood serum of rat. methods the rp-hplc method was applied as with: kromasil c18 column(250 mm×4.6 mm,5 μm) and easyguard column. the mobile phase was acetonitrile and 1% acetic acid with linearity gradient elution, the flow rate at 1 ml·min-1, and detection wavelength was 278nm. resultsan excellent linearity was obtained over the range of 1.46~146 μg·ml-1. the rsds of accuracy for 7.3, 29.2, 146μg·ml-1 were 1.05%,0.59%,0.80%, respectively (n=5). the rsds of intra-day validation were 1.00%. the mean recovery rates of harpagoside in preparation and serum were (98.02±1.01)%, (101.03±1.64)%,respectively. the rsds of the determination method for preparation and serum repeatability were 0.73% and 0.96%, respectively. the content of harpagoside in preparation and serum was 230.5μg·g-1 and 1.88μg·ml-1, respectively.conclusionthe method is simple, rapid, reliable and repeatable. it’s quite suitable for the analysis of harpagoside in jia zhong xiao preparation and of rat serum.

key words:harpagoside; jia zhong xiao preparation; spe; rp-hplc

甲肿消处方由玄参、夏枯草等组成,按适当工艺制备成浓度为3g·ml-1饮片的浸膏剂。动物和临床试验证明本制剂具有较好的化痰散结、治疗甲亢型甲状腺肿大的作用。处方中玄参具有凉血滋阴、泻火解毒的功效,用于热病伤阴、津伤便秘、目赤、咽痛等症[1],其含量较高的特征性成分为哈巴俄苷,有抗慢性炎症、降压、镇痛、解痉、抗乙型肝炎病毒和免疫促进等作用[2,3]。因此,我们采用反相高效液相色谱法建立了浸膏和大鼠血清中的哈巴俄苷的含量测定方法,为进一步阐明本方治疗甲亢的机理和控制制剂质量提供分析方法。

1 仪器与材料

1.1 仪器knaver 液相色谱仪、knaver uv detecter(德国knaver公司);kromasil c18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);easyguard保护柱(迪马公司);me215p型电子天平;wh-90a微型旋涡混合机;tgl-16c台式高速离心机;b600b型医用低速离心机;固相萃取小柱(c18,200 mg,60 μm,3 ml,瓦里安公司)。

1.2 药品和试剂哈巴俄苷对照品(批号为200501)购自中国药检所;药材购自同仁堂药店;乙腈为色谱纯,冰醋酸为分析纯,水为高纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件色谱柱为kromasil c18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),以乙腈和1%醋酸溶液为流动相,采用梯度洗脱,比例见表1;流速:1 ml· min-1;检测波长为278nm;进样量:5 μl。色谱图结果见图1。表1 乙腈:1%冰醋酸流动相梯度表(略)

2.2 甲肿消制剂和大鼠含药血清的制备甲肿消制剂的制备:将玄参、夏枯草等饮片按适当的比例配制,加水煎煮提取,提取液过滤,浓缩得浓度为生药3 g·ml-1的浸膏剂。大鼠含药血清的制备:选取体质量(330±20)g的雄性wistar大鼠30只,其中20只按生药15 g·kg-1的剂量灌胃给予甲肿消浸膏剂,10只按体质量给予同容积生理盐水,2次/d,连续7 d,末次灌胃后1 h,用玻璃毛细管自乙醚麻醉大鼠眼底采血,收集血样于离心管中,放置2 h促凝,1 500 r·min-1离心10 min,吸取上清液,0.22 μm滤膜过滤,滤液即为含药血清和空白血清,-20℃冷冻保存。

2.3 甲肿消样品的前处理方法精密称取甲肿消浸膏约2 g,用30%甲醇(25,20,20 ml)超声提取3次,提取时间分别为30,20,20 min,提取液离心10 min,转速为3 500 r·min-1,3次上清液合并,浓缩至微干,再用30%甲醇溶解并定容至25 ml,0.45 μm滤膜过滤,滤液按“2.1色谱条件”项进行含量测定。

2.4 含药血清中哈巴俄苷的前处理方法将c18spe柱先用2 ml甲醇冲洗,再用2 ml水冲洗活化待用;精密移取解冻后的含药血清2 ml,上样于处理好的spe柱中,先用4 ml水冲洗,再用2 ml甲醇洗脱,洗脱液过滤,滤液按“2.1色谱条件”项进行含量测定。

2.5 标准曲线的测定取适量哈巴俄苷对照品,置于样品瓶中,在五氧化二磷干燥器中干燥12 h后,精密称定3.65 mg,用30%甲醇配制成浓度为146 μg·ml-1的标液,然后用30%甲醇稀释成浓度分别为2.92,7.3,14.6,29.2,73 μg·ml-1的标液,按“2.1色谱条件”项测定,以浓度c为横坐标,以峰面积a为纵坐标进行回归,得到标准曲线方程:a=0.218 1 c+0.096 2, r2=1,哈巴俄苷在2.92~146 μg·ml-1范围内线性关系良好。

取浓度为146 μg·ml-1的哈巴俄苷标液适量,用空白血清分别稀释到200 μl,涡漩混匀,使其浓度依次为1.46,3.65,7.3,14.6,29.2,73 μg·ml-1,离心,上清液按“2.1色谱条件”项测定,以浓度c为横坐标,以峰面积a为纵坐标进行回归,得到标准曲线方程:a=0.186 3c+0.051 5,r2=0.999 4,血清样品中哈巴俄苷在1.46~73 μg·ml-1范围内线性关系良好。

2.6 精密度和稳定性的测定选浓度为7.3,29.2,146 μg·ml-1的哈巴俄苷对照溶液,分别连续进样5次,按“2.1色谱条件”项测定,记录色谱图,将峰面积代入线性方程中,求出计算浓度,并计算相对标准偏差(rsd)。结果见表2。表2 哈巴俄苷标液的精密度和回收率(略)

选浓度为29.2 μg·ml-1的哈巴俄苷对照溶液,连续5 d进样,按“2.1色谱条件”项测定,记录色谱图,计算其日间差(rsd)为1.00%。

选浓度为3.65,14.6,73 μg·ml-1的哈巴俄苷血清对照溶液,分别连续进样5次,按“2.1色谱条件”项测定,记录色谱图,将峰面积代入线性方程中,求出计算浓度,并计算相对标准偏差(rsd),结果见表3。表3 哈巴俄苷血清标液的精密度和回收率(略)

选浓度为14.6 μg·ml-1的哈巴俄苷血清对照溶液,连续5天进样,按“2.1色谱条件”项测定,记录色谱图,计算其日间差(rsd)为0.63%(n=5)。

2.7 加样回收率的测定精密称取已知含量的甲肿消制剂5份,再精密加入已知浓度的哈巴俄苷对照溶液,分别按“2.3”项和“2.1”项操作,测定其含量,将峰面积代入线性方程计算哈巴俄苷的浓度,计算平均回收率为(98.02±1.01)%,并求精密度rsd为1.03%。

精密量取空白血清5份,再精密加入已知浓度的哈巴俄苷对照溶液,分别按“2.4”项和“2.1”项操作,测定其含量,将峰面积代入线性方程计算浓度,计算平均回收率为(101.03±1.64)%,并求精密度rsd为1.63%。

2.8 重复性实验精密称定甲肿消浸膏6份,称量量分别为2.047 2,2.028 8,2.043 1,2.027 4,2.057 0,2.044 g,按照“2.3”项中供试品溶液的制备方法制备6份样品,分别取5 μl进样,按“2.1色谱条件”项测定,记录色谱图。根据峰面积计算哈巴俄苷的含量,并求得6次测定的rsd为0.73%。

精密移取含药血清2 ml,按“2.4”项中含药血清供试液的制备方法制备6份样品,分别取5 μl进样,按“2.1色谱条件”项测定,记录色谱图。根据峰面积计算哈巴俄苷的含量,并求得6次测定的rsd为0.96%。

2.9 甲肿消制剂和大鼠血清中哈巴俄苷的测定精密称定甲肿消浸膏2.037 5 g,按“2.3”和“2.1”项操作,记录色谱图,根据峰面积和线性方程计算,每克制剂中含哈巴俄苷的量为230.5 μg;精密移取含药血清2 ml,按“2.4”和“2.1”项操作,记录含药血清中哈巴俄苷的峰面积,根据峰面积和其线性方程计算,每毫升含药血清中哈巴俄苷的量为1.88 μg。

3 讨论

实验中采用《中国药典》2005版玄参项下的色谱分析方法,但在测定浸膏样品时,20 min左右有一个较大的峰出现,若此时停止样品的测定,即进下个样品时,会影响后续测定,所以将时间延长到25 min;在测定完一个样品时,需要将流动相调至初始比例,运行4 min左右,等柱压稳定在初始水平时,即可进样,否则哈巴俄苷色谱峰的保留时间容易受影响;测定样品时发现当室温在17℃以上时,哈巴俄苷色谱峰的分离度r>1.5,当温度过低时,哈巴俄苷色谱峰受干扰峰影响,分离度r<1.5,因此,室温应维持在17℃以上。

有文献[3]报道玄参中哈巴俄苷的提取溶剂采用30%甲醇提取效果较好,因此本实验在考察甲肿消样品的预处理方法时,重点考察了提取时间、溶剂用量和提取次数,结果显示当提取时间为30 min、提取3次时,能较完全地提取哈巴俄苷成分,因此试验采用提取3次,每次提取时间分别为30,20,20 min进行样品制备。

由于大鼠血清中哈巴俄苷含量很低,采用常规液液萃取方法哈巴俄苷的浓度很低,难于定量,回收率也不高。因此试验中采用固相萃取法处理血清样品,经精密度和回收率实验证明本方法可行,可用于测定血清中哈巴俄苷的含量。

【参考文献】

1]国家药典委员会.中国药典,ⅰ部[s].北京:化学工业出版社,2005:76.

[2]谢丽华,刘洪宇,钱瑞琴,等.哈巴苷与哈巴俄苷对阴虚小鼠免疫功能及血浆环化核苷酸的影响[j].北京大学学报(医学版),2001,33(3):283.

[3]蔡少青,谢丽华,王建华,等. 中药玄参中哈巴俄苷与肉桂酸的高效液相色谱法测定[j].药物分析杂志,2000,20(3):191.

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