凝胶色谱法测定头孢菌素类药物中高分子杂质的应用心得

【摘 要】在对头孢菌素类药物中的高分子杂质进行测定的过程中，主要选择的是凝胶色谱法。主要是由于这种方式不仅测定方式比较简单，而且分离效果比较明显，操作方式比较常见。在实际的研究和测定的过程中，研究人员对对这一技术加强重视，现如今已经在医药研究领域中得到高效地推广。在本文中，笔者主要对凝胶色谱法对头孢菌素类药物中的高分子杂质进行测定的方式进行分析和探讨，希望能够给相关的药物研究人员提供借鉴和参考。

【关键词】凝胶色谱法；头孢菌素类药物；高分子杂质；测定方法

从现如今我国医药临床研究中可以看出，有些药物对人体会造成一定的过敏性，这和药物中的高分子杂质的含量之间存在着必然的联系。从实际的判断中可以看出，要想保证药品的安全性，药物研究人员应该对高分子杂质的数量进行控制，减少其对人体健康的威胁。为了保证药物的整体质量。工作人员需要对纯度进行测定。工作人员所采用的测定方式就是凝胶色谱法。

一、实验过程中的注意事项

研究人员在对头孢菌素类药物进行测定的过程中，主要采用的是凝胶色谱法。在测定的过程中要经过严格地检定。保证实验操作的规范性和科学性，这样才能够提升测量结果的精准度。

1、仪器准备

在实验进行之前，做好准备阶段的工作至关重要，在检测之前，工作人员要对实验仪器和设备等进行检测，包括每一个检测单元、输液单元。在检测之后需要做好记录。进行这一环节主要是为了有效的满足紫外检测工作基本要求，提升输液单位的流速，进而在检测的过程中发出相对比较科学的模拟信号。在设备和系统使用的过程中，工作人员主要涉及到液相色谱仪，保证检测的精准度是至关重要的。只有做好定期的检定工作，才能提升实验结果的高效性

2、凝胶色谱柱准备

研究人员在选择色谱柱的过程中，需要将仪器设备的耗能量，溶解能力等方面列入到检测工作的行列中。一般情况下，胶凝色谱柱的体积明显低于柱床的体积。为了满足这一要求，头孢菌素的抗生素高分子杂质所在柱床的体积要达到60ml以上。

3、玻璃柱管的分端凝胶介质的选取

一般来说，在玻璃柱管的分端上会存在着一个玻璃棉在其顶端。如果条件不允许的话可以采用过滤板或者是可以调节的商品玻璃珠管。采用这种方式的过程中，凝胶类型有很多种。其中数量较多的就是采用葡聚糖凝胶。在使用的过程中，工作人员需要做好溶胀工作。根据凝胶柱的体积来计算其余的用量。经过蒸馏水泡过之后，玻璃柱管可以长时间的放置。只需要在热水中煮沸，就可以保证其充分溶胀。需要注意的是，这两种不同的溶胀方式应该将气泡挤压出去，实现真空脱气。

4、装柱

如果凝胶介质经过了充分的溶胀，就需要用蒸馏水来对其悬浮，去除其中的杂质。按照这种方式进行洗涤，直到表面上层的溶液达到澄清状态。通过具体的实践可以看出，凝胶介质可以用水来配置悬浆，然后将其倒入玻璃柱中，直到其完成沉降滞后就可以实现装柱。不仅如此，垂直放置的玻璃珠管应该保持顺畅，在其中加入一定量的凝胶悬浆，可以促进凝胶颗粒沉降的科学性。同时还应该让漏斗保持凝胶悬浆，这种方式在应用等等过程中，装柱之间明显增强，在需要的时候可以采用增加负压的方式来提升装柱时间。

二、系统适用性实验

在实验的过程中，采用系统适用性实验不仅可以提升溶液制备工作的高效性，还可以促进其可操作性。溶液的配置所采用的方式比较简单，主要是实现主成分和杂质的混合配置。

但还是会使得有些杂质对照品不能得到，如性质不稳定或分离提取技术要求太高等，但这些杂质峰恰恰又是与主成分峰最难分离的色谱峰。系统适用性试验目前包括很多内容，主要考察对照品测定系统与高分子杂质测定系统中蓝色葡聚糖2000溶液峰的保留时间的比值，以及理论板数和拖尾因子，以此来控制对照品测定与高分子杂质测定时仪器状态的同一性。

三、操作方法上的注意事项

1、样品溶液及对照溶液的制备

具体操作中必须要按规定的标准来配制样品溶液，由于某些高浓度抗生素溶液具有一定的不稳定性，所以通常对样品溶液采取即溶即进的形式。对照溶液的制备上，要注意头孢菌高分子杂质的含量测定，通常以样品自身在SDS水溶液或纯水中的缔合物作为对照进行定量。在制备缔合物时特别要注意对浓度及水的纯度的控制，以此来保证缔合完全。

2、进样及进样方式

一般在对头孢菌素高分子杂质含量进行测定时，通常需要不同状态的流动相，选择出合适的对照溶液进行进样。因此，只有事先将流动相更换之后，才能充分保证凝胶色谱柱的平衡性。并且，笔者建议尽量采用凝胶色谱仪自动进样方式，或是在特殊情况下，选择手动进样。然而，无论是任何一种进样方式，在实验中，都必须保证色谱柱端无缝隙处，从而避免样品扩散，影响分离效果。另外，在对头孢菌素高分子进行自动取样的过程中，也要切实遵守相关的液相色谱操作规程。

3、凝胶面的平整

如果选择了手动进样方式，就一定要保证凝胶表面的平整性和完整性。并在进样之前，事先使用滴管吸取掉凝胶表面积压的液体，确保色谱柱下端能够顺利流通，直到色谱柱内的溶液流降到凝表面时，我们才可以应用相应的定量器具，对样品溶液进行精密的量取。之后，我们还需要将样品溶液滴加到色谱柱的凝胶表面中，同时还要对色谱柱管内壁上残留的样品溶液进行清洗。最后，也是最重要的一个实验环节，相关实验人员要在色谱柱顶端缓慢注入适量的流动相，认真做好进样时间的记录工作。

4、记录对照及结果

要分别记录样品和对照溶液的色谱图，积分对照溶液的峰面积和样品溶液中处于外水体积的高聚物杂质面积，按外标法以峰面积计算样品中高分子杂质的含量。按平行实验的平均值作为样品中高分子杂质含量的最终结果，并与标准规定限度比较后作出是否符合规定的判断。

5、样量分析

在一般高效液相色谱仪上使用凝胶柱，应严格限制泵压。由于一般高压液相色谱管路和检测器通路狭窄，极易发生堵塞，所以要注意尽量减少将出柱液连接到检测器的时间，尤其是新填充的色谱柱更应经水或流动相充分平衡后再连接到检测器。

四、结束语

通过实验结果表明，大部分抗生素药物中的高分子杂质已经超出了药物本身的杂质，严重影响了药物质量，残留了部分污染物质，再加之抗生素在贮存过程中，其分子很容易发生聚合反应，最终产生大量的聚合物杂质，大大降低了药品的纯度。因此，采用高效的凝胶色谱法对头孢菌素中的高分子杂质含量的测量是非常至关重要的，操作人员必须严格遵守相应的检测要求，加强对凝胶色谱法的合理运用及改进，进一步提高头孢菌素类型药物的质量和纯度，从而达到理想的治疗效果。■

参考文献

[1]乔海灵，赵永星，马统勋.青霉素类抗生素过敏反应机制及诊断的新近研究进展[J].国外医药（抗生素分册）.2012（05）

[2]顾立素，胡昌勤，金少鸿.安美汀中高分子杂质的分离分析与质量控制[J].药物分析杂志.2011（01）

[3]胡昌勤，金少鸿，孙学兰.离子对凝胶色谱法分离头孢菌素中高分子杂质[J].中国抗生素杂志.2010（05）