黄芪对肝纤维化的防治作用

[摘要] 目的:观察黄芪的抗肝纤维化作用,初步探讨黄芪抗肝纤维化的机制。方法:设立正常对照组、模型组和黄芪处理组,以四氯化碳(CCl4)皮下注射复制大鼠肝纤维化模型,黄芪处理组在造模的同时给予皮下注射黄芪注射液。常规HE染色观察肝脏病变,天狼猩红胶原染色、肝组织羟脯氨酸(HYP)含量测定观察肝纤维化程度;产色基质偶氮法鲎试剂定量测定血浆内毒素,赖氏法测定血浆丙氨酸氨基转移酶(ALT);TBA法检测肝组织丙二醛(MDA)水平。结果:黄芪处理组与模型组比较,①肝脏的损伤性改变有所减轻,肝组织HYP及肝纤维化指数(FI)明显降低;②血浆内毒素含量、ALT及肝组织MDA均有不同程度的降低。结论:黄芪可减缓肠源性内毒素血症,可能为防治肝纤维化的作用机制之一。

[关键词] 内毒素;肝纤维化;黄芪

[中图分类号] R285.5[文献标识码]A [文章编号]1673-7210(2010)03(c)-015-03

Inhibitive effect of Astragalus on hepatic fibrosis

WANG Dengni1, XU Junquan1*, SONG Weifang1, ZHANG Xiaoyang2, WANG Mingliang1, LIANG Yonggang1

(1.Science and Technology Center, Fenyang College of Shanxi Medical University, Fenyang 032200, China; 2.Department of Pathology, the Second Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin 300211, China)

[Abstract] Objective: To observe the action of Astragalus on anti-hepatic fibrosis, in order to probe into the mechanism of Astragalus in resisting hepatic fibrosis. Methods: Normal control group, model group and Astragalus treatment group were set in the experiment, model of hepatic fibrosis was induced by subcutaneous injection of carbon tetrachloride (CCl4). Astragalus treatment group was given subcutaneous Astragalus when establishing models. Liver tissues were stained with hematoxylin-erosin to observe liver injury. The degree of liver fibrosis was observed by stained of sirius red of collagen and the content of hydroxyproline in liver tissues. Endotoxin was measured with a limulus amebocyte lysate test kit. Plasma alanine aminotransferase (ALT) was determined with Reitman-Frankel method; the content of malondialdehyde (MDA) in liver tissue was determined with TBA method. Results: Astragalus treatment group compared with model group: ①changes in liver damage were relieved, HYP in liver tissue and hepatic fibrosis index (FI) were significantly reduced; ②plasma endotoxin, ALT and liver MDA were reduced to different degrees. Conclusion: Astragalus can alleviate CCl4-induced liver injury, stave happening and developing of hepatic fibrosis; Astragalus can reduce intestinal endotoxemia, which may be one of the mechanisms contributing to the prevention and treatment of Astragalus on liver fibrosis.

[Key words] Endotoxin; Hepatic fibrosis; Astragalus

在抗肝纤维化的众多药物中,中药黄芪及其复方制剂是一类有很大发展潜力的药物。以往的动物实验结果显示,黄芪具有抑制肝组织胶原沉积和防治肝纤维化的作用,还可改善肝脏微循环,增强网状内皮系统的吞噬功能,促进肝再生。然而有关其抗肝纤维化的机制还有待进一步研究。内毒素可激活肝枯否细胞(Kupffer cell,KC)合成与释放细胞因子(cytokine)和炎症介质,并在肝纤维化的发生及发展中发挥作用,内毒素通过诱导TNF-α产生[1],促进成纤维细胞和间质细胞增殖和分化,使细胞外基质(extracellular matrix,ECM)产生增多。本研究通过观察黄芪对慢性肝纤维化过程中血浆内毒素水平的影响及意义,进一步探讨黄芪防治肝纤维化的作用机制。

1材料与方法

1.1动物及材料

健康清洁级雌性Wistar大鼠,体重(230±20) g,购自山西医科大学实验动物中心;四氯化碳(CCl4)为中国中邦化工分析纯;鲎试剂盒购自上海伊华医学科技公司,天狼猩红、固绿FCF、羟脯氨酸(HYP)标准品购自美国Sigma公司;黄芪注射液(成都地奥九鸿制药厂),丙二醛(MDA)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所第一分所),丙氨酸氨基转移酶(ALT)试剂盒(北京北化康泰临床试剂有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分组30只Wistar大鼠饲养1周后随机分为三组,A组(正常对照组)、B组(模型组6周)、C组(黄芪处理组6周)。

1.2.2 造模A组不给予处理,其他两组给予首剂5 ml/kg体重皮下注射CCl4分析纯,然后按3 ml/kg体重皮下注射40% CCl4植物油(V/V)混合液,每周2次。C组于造模同时给予皮下注射黄芪注射液[800 mg/(kg・d)][2]。

1.2.3 取材在无菌无热源条件下,从大鼠腹主动脉采血,注入加有肝素的无热源玻璃试管中,离心取血浆置于玻璃试管中封口,低温保存。取新鲜肝左叶一部分立即固定于4%多聚甲醛中,24 h内石蜡包埋;一部分于-80℃保存。

1.2.4 染色行常规HE染色。

1.2.5天狼猩红胶原染色组织切片用天狼猩红染液室温孵育60 min,中性树胶封片,显微镜下进行观察。

1.2.6 肝组织HYP含量测定取冻存肝组织约0.2 g消化,取肝脏消化液1.0 ml,对照管为1.0 ml去离子水,然后依次加入:①0.1 mol/L柠檬酸缓冲液(pH 6.0)0.5 ml和0.05 mol/L氯胺T溶液1.0 ml,37℃水浴25 min;②3.15 mol/L过氯酸溶液1.0 ml,室温下作用5 min;③10%对二甲氨基苯甲醛溶液1.0 ml,100℃沸水5 min;④冰浴冷却,测定560nm处吸光度。制备标准曲线,在HYP标准曲线上求得待测肝组织HYP含量。

1.2.7产色基质偶氮法鲎试剂测定血浆内毒素参照试剂盒说明书操作。

1.3 统计学处理

数据以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS 11.5软件进行分析,行单因素方差分析(One-way ANOVA),SNK(q检验)进行两两比较,P

2 结果

2.1一般情况及造模效果

实验过程中,正常对照组大鼠健康状况良好,肝脏表面光滑,颜色红润;模型组大鼠的活动及摄食减少,精神萎靡,体重下降,皮毛杂乱无光泽,肝脏表面不光滑,颜色灰暗,体积变大,边缘圆钝,肝组织HYP含量和肝FI明显升高;黄芪处理组大鼠症状比模型组轻,体重下降比较慢,肝组织HYP含量和肝FI比模型组降低,结果见表1。

2.2 HE染色

正常对照组肝组织结构清晰,肝细胞大小均匀,无变性、坏死,肝小叶结构存在,小叶内肝细胞索排列整齐;模型组肝细胞可见明显脂肪变性,汇管区纤维组织明显增生;黄芪处理组纤维组织增生不明显(图1)。

ABC

图1各组肝组织病理学检测结果

(A.正常对照组;B.模型组;C.黄芪处理组。HE×40)

2.3 胶原染色

显微镜下重点观察红色胶原纤维分布情况。正常对照组仅于血管周围见少量红色纤维;模型组肝组织中红色纤维明显增多,由汇管区和中央静脉向肝小叶内伸展分隔,相互连接形成较粗大的纤维间隔;黄芪处理组见较细的红色纤维走行于血管周围,数量较正常对照组稍多(图2)。

A BC

图2各组肝组织病理学检测结果

(A.正常对照组;B.模型组;C.黄芪处理组。胶原染色,×40)

2.4 黄芪对血浆内毒素、ALT和肝组织MDA变化的影响

黄芪处理组与模型组比较,血浆内毒素、ALT和肝组织MDA均明显降低,结果见表1。

3讨论

研究显示,血浆内毒素水平在肝纤维化过程中逐渐升高,提示肠源性内毒素血症在肝纤维化发生及发展中起重要作用[3-4]。内毒素通过诱导TNF-α和IL-1[5]产生,促进成纤维细胞和间质细胞增殖和分化,使细胞外基质(extracellular matrix,ECM)产生增多。降低血浆内毒素水平可阻断上述途径,逆转肝纤维化。

目前,治疗肝纤维化是防治慢性肝病发展为肝硬化的重要手段,寻找有效抗肝纤维化的药物是研究热点,在抗肝纤维化的众多药物中,中药黄芪及其复方制剂是一类有很大发展潜力的药物。黄芪能够减少免疫损伤所致肝内胶原成分的异常沉积,对实验性肝纤维化有明显的治疗作用,且随着疗程的延长,其作用有所增强[6-7]。黄芪注射液的主要成分是黄芪总黄酮、黄芪总皂苷和黄芪多糖,具有益气养心、扶正祛邪的功效。张银娣等[8]研究了黄芪皂苷对实验性肝损伤的保护作用,证实黄芪可保护肝细胞膜,降低血清ALT、AST水平。MDA是一种脂质过氧化物,其组织中的含量可反映机体内脂质过氧化的程度[9]。肝纤维化的形成有多种细胞因素的参与,与氧自由基、脂质过氧化产物等密切相关[10]。有研究报道黄芪有抗脂质过氧化、抗氧自由基的作用[11]。张等[12]的研究提示复方黄芪颗粒可以在蛋白水平增强MMP-2酶蛋白的表达,同时抑制TIMP-2酶蛋白的表达,促进ECM的降解,从而达到逆转肝纤维化的目的。然而黄芪防治肝纤维化的作用机制尚不很清楚。

本实验对黄芪抗肝纤维化的机制进行了初步研究,笔者通过观察黄芪对肝纤维化过程中血浆内毒素水平的影响来探讨黄芪抗肝纤维化的作用机制。从肝组织病理学、HYP含量和肝FI方面证实黄芪可以防治CCl4所致的肝纤维化;黄芪在抑制大鼠肝纤维化过程中,可降低血浆内毒素水平,使肝纤维化程度减轻。本实验同时观察到黄芪在防治肝纤维化过程中可以降低血清ALT、肝组织MDA等水平,发挥抗肝纤维化作用。从本实验结果可推测黄芪的抗肝纤维化可能与其减缓肠源性内毒素血症有关。黄芪对内毒素的下游传导通路是否有影响有待进一步研究。

[参考文献]

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[2]周贤,戴立里,贾丽萍,等.黄芪注射液对CCl4诱导的大鼠肝纤维化的防治[J].重庆医科大学学报,2005,30(1):50-52.

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[8]张银娣,沈建平.黄芪皂苷抗实验性肝损伤作用[J].药学学报,1992,27(6):401-406.

[9]罗瑞虹.肝纤维化的血清学诊断[J].国外医学:内科学分册,1999,26(5):208-210,217.

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[11]汪德清,沈文梅.黄芪活性提取成分对膜脂质过氧化损伤的防护作用[J].中国中药杂志,1996,21(12):746-748.

[12]张,李筠,赵景民,等.复方黄芪颗粒对肝纤维化大鼠肝脏基质金属蛋白酶-2、金属蛋白酶组织抑制因子-2蛋白表达的影响[J].中西医结合肝病杂志,2008,18(4):242-244.

(收稿日期:2009-12-17)