运动疲劳诱导大鼠纹状体c-jun蛋白表达图谱变化的研究

摘 要: 目的:通过绘制运动疲劳后cjun蛋白在纹状体神经核团中的表达图谱,寻找运动疲 劳后纹状体神经元应激敏感区,探讨其在运动疲劳中枢调控中的作用。方法:雄性SD大鼠随 机分为对照组和实验组,采用免疫组化法观察十天递增负荷游泳运动疲劳后即刻、12 h和24h纹状体喙侧层面、中间层面、近尾侧层面和尾侧层面cjun蛋白的表达。结果:纹状体中 间层面的背外侧区和腹外侧区中,12 h和24 h阳性细胞面密度值显著高于即刻组(P

关键词:运动疲劳;纹状体;即刻早期基因;cjun蛋白

中图分类号:G804.2文献标识码:A文章编号 :1007-3612(2010)03-0055-03

Influence of Exerciseinduced Fatigue on the Expression of Imme diate Early Gene in Rats’ Striatum

HOU Lijuan,LIU Xiaoli, QIAO Decai

(Physical Education and Sports College, Beijing Normal Universi ty, Beijing 100875, China)

Abstract:Objective: to draw the cjun protein expression figure after e xerciseinduced fatigue in order to find out the sensitivity area in striatum,and discuss its role of striatum in central regulation. Methods: Tenday loadi ncreasing swimming exercise protocol is used to set up exercise fatigue animal m odel. SABC method is used to investigate the cjun protein expression at diffe r ent time in different area in striatum. Results: At the beak part, OD of cjunexpression cells in at dorsal part is significantly higher than those of controlgroup after exercising 24 h(P

Key words: exerciseinduced fatigue; striatum; immediate early gene; c jun protein

纹状体是基底节中接受传入信息的主要核团,不仅参与随意运动的程序编制与执行,在 调节运动方向、顺序、速度和幅度等方面发挥作用,而且在运动可塑性如习惯形成和条件行 为等方面也起着特殊作用[1]。本实验室前期工作观察到运动疲劳后纹状体神经元 自发放电频率发生改变,高频放电神经元比例显著增高,即纹状体在运动疲劳中枢调控中起 着重要作用[2]。纹状体核团的神经元与大脑皮层感觉运动区、黑质以及苍白球等 发生广泛突触联系,受到不同类型神经递质的调控,使纹状体出现一定的功能分区[3 ]。为了更好地从区域特性角度寻找纹状体神经元对运动应激的反应,根据即刻早期基因 (immediate early gene, IEG)能在数分钟内对外界刺激引起的神经递质、激素、神经冲 动等信息进行快速表达的特征[4]。本实验将观察c-jun蛋白在运动疲劳后纹状体核 团不同层面中的表达变化,揭示纹状体神经元在运动疲劳中枢调控中的时效机制。

1 实验对象与方法

1.1 实验动物及分组

实验选取雄性SD大鼠,体重(250±20)g。动物分笼饲养,自然光照,动物房内温度(20±3) ℃,相对湿度为50%～70%。动物分组包括:对照组(Control Group, CG)6只;实验组( Experiment Group, EG)

投稿日期:2009-08-17

基金项目:国家自然科学基金资助项目(No. 30771050; 30971416)。通 讯作者:乔德才。

作者简介:侯莉娟,讲师,博士,研究方向运动生理学。 18只,实验组根据取材时间分为即刻组,12 h组和24 h组,每组6 只。

1.2 运动疲劳动物模型的建立

动物完成3 d适应性游泳运动(15 min/day)后开始建模,参照本实验室建立的十天递增负 荷游泳运动方式[5]。训练时间为10 d,训练在直径为120 cm的塑钢圆桶中进行, 静水深90 cm,水温(30±1)℃。第1～2 d动物游泳训练时间为30 min,第3～5 d每天递增3 0 min,第6～7 d每天进行一次力竭性游泳训练,第8～10 d每天进行2次力竭性游泳训练, 次间间隔6 h。游泳训练期间对动物运动能力及活动状态进行观察。对照组相同条件饲养, 不参加游泳训练。实验组大鼠模型结束后分别在即刻、12 h和24 h取材。

1.3 组织切片与染色

1.3.1 样本制备10%水合氯醛按0.35 mL/kg腹腔麻醉大鼠,灌注生理盐水100 mL后用4%多聚甲醛200 mL灌 注30 min。取出脑组织置固定液中下沉后进行冰冻切片。脑组织放入异戊烷中,置于液氮冷 冻10 s,迅速放入冰冻切片机舱内,切片温度-20℃,进行连续冠状切片,片厚40 μm,放 入0.01 m PBST溶液中待染。

1.3.2 免疫组化染色1) 吸净PBST,加入HCl,室温30 min;2) 3%H2O2室温、摇床孵育30 min;蒸馏水洗3 次,每次5 min;0.01 m PBST,洗3次,每次5 min,10%山羊血清室温、摇床孵育30 min; 3)加适当稀释度的相应一抗(Aβ1-40 1:800;PSD-951:1 000;Shank1:1 000;TrkA1:200 ;MAPK1:1 000;p-CREB1:1 000),4℃过夜;4) 生物素标记的抗鼠二抗(稀释度为1:300 ),室温、摇床孵育2 h;5) 加入稀释度为1:200的生物素抗体-过氧化物酶标记的链霉卵 白素,室温、摇床孵育2 h;6) 加入DAB工作液显色,显微镜下观察染色情况,将玻片放 入二甲苯中透明、中性树胶封片。阴性对照省去一抗,用0.01MPBS代替。

1.4 数据处理

使用Visilog 5.0 by Noesis图像采集系统,从喙侧到尾侧以前囟为标准基点,在2.2- 1.5、1.4-0.1、0.0--0.5、-0.6--2.0的层面范围选取脑片,每张脑片的每个分 区中选取 一个代表性视野进行观察,记录阳性细胞平均面密度值(Area Density, AD)和光密度值( Optic Density, OD)。所有数据以表示,并用SPSS13.0进行统计,各组间差异用多因素方 差分析检验,P

2 实验结果

2.1 运动疲劳后纹状体神经元c-jun蛋白的表达光镜下运动疲劳后大鼠纹状体神经元c-jun蛋白免疫反应物质呈颗粒状,位于神经细胞 核内,可见胞体及凸起。冰冻切片使得纹状体部位出现空泡,对神经元结构观察造成一定的 影响,但不影响神经元光密度和面密度的统计。阳性胞体多为三角形和菱形,直径大多10～ 20 μm,多为中型细胞,阳性细胞表达以中间层腹外侧区最为显著。正常对照组动物在上述 脑区偶见零星c-jun蛋白的表达,但染色相对较弱。

2.2 运动疲劳后c-jun阳性细胞在纹状体表达的时空特点纹状体神经核团从喙侧到尾侧以前囟为坐标点,根据神经元解剖结构与面积大小划分为 :喙侧层面(2.2-1.5)、中间层面(1.5-0.0)、近尾侧层面(0.0--0.5)以及 尾侧层 面(-0.5--2.0)四个部分。喙侧层面又按照腹侧区(Ventral, V)、背侧区(Dorsal,D )进行阳性细胞统计;中间层面和近尾侧层面按照背外侧区(Dorsal Lateral, DL)、背内 侧区(Dorsal Media, DM)、腹外侧区(Ventral Lateral, VL)、腹内侧区(Ventral Med ia, VM)进行统计;尾侧层面按照背内侧区、背外侧区和腹外侧区进行统计[6]。

图1 对照组cjun蛋白表达(×400) 图2 24 h cjun蛋白表达(×400 )图3 运动疲劳后纹状体不同分层c-jun蛋白表达的图谱

注:“L”表示“location”每张脑片代表的层面;“B”表示脑片距离

前囟的前后距离,图层中的黑色框区表示本张切片中的纹状体

神经核团的范围;右侧阴影区为c-jun蛋白阳性细胞表达区。 在喙侧层面脑片中,可观察到少量阳性细胞的表达,细胞染色相对较浅,阳性细胞零星分布 在背侧及腹侧区域;实验组运动后12 h背侧区域阳性细胞光密度值有所升高,但与对照组相 比未出现显著差异;24 h背侧区域阳性细胞光密度值(109.33+23.44)显著高于对照组(101 .33+13.89)(P

3 分析讨论

3.1 运动疲劳对纹状体c-jun蛋白表达区域差异性的影响纹状体作为基底神经节中接受传入信息的主要核团和信息整合的重要中继站,受到不同 类型神经末梢释放的递质如谷氨酸(glutamate, Glu)、γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyricacid, GABA)以及多巴胺(dopamine, DA)等的调控,且与传入核团的神经投射存在一定的区 域对应性,说明在不同区域神经元功能会有所差异[7]。

纹状体的立体形态呈近似内凹半球形,从喙侧到尾侧随着脑平面的增宽逐渐向外侧(即 靠近外轮廓的方向)移位。纹状体的空间立体构型决定了不同位置不同区域的神经元功能存 在一定的差异[6]。本实验中纹状体中间和近尾侧层面中c-jun在背外侧区有高表达 ,而此区域对运动控制起着重要的调控作用。

纹状体背外侧的不同区域接受广泛黑质(substantia nigra, SN)的DA投射,即纹状体腹 侧向SN背侧部位投射密集的GABA纤维,SN腹外侧区神经轴突与纹状体背侧区神经元胞体形成 广泛的突触联系。West等的实验观察到,纹状体中与肢体运动相关的神经元位于其外侧区, 尤其是背外侧区,与前肢技巧性运动和肢体操作式运动相关的神经元部分分布在外侧纹状体 ,提示大鼠纹状体神经元的分布有一定的功能定位[8]。腹侧纹状体神经元向广泛 的SN的D A神经元传导信号,而背侧神经元是接受DA细胞传入的主要区域。与本实验观察到c-jun高表 达的区域相近,本实验室前期工作观察到运动疲劳后纹状体高频放电神经元和爆发式放电神 经元分布也集中在纹状体的外侧区域,提示运动疲劳后神经元电变化的区域特征性与纹状体 神经元分布与接受投射的区域特征性之间存在高度相关。

3.2 运动疲劳对纹状体c-jun蛋白表达时间差异性的影响Timofeeva等观察到运动后即刻c-fos mRNA基因表达明显增强,但运动后2H恢复到安静 水平,IEG对不同运动强度引起的应激反应程度有所差别,恢复程度有所不同,随着运动强 度的增加,c-fos mRNA基因表达明显增加;随着低强度运动时间的延长,c-fos mRNA基因表 达增加持续到第7周,然后降低,提示神经元活性与运动强度和持续时间密切相关[9] 。本研 究中经过10 d递增负荷游泳运动后纹状体中间层面和近尾侧层面的腹侧背侧区均出现c-jun 蛋白表达的增强,说明运动疲劳对纹状体中间及近尾侧区神经元构成一定的刺激效应,使神 经元产生应激,出现c-jun蛋白的表达[10]。本研究中实验组大鼠纹状体不同层面 出现c-jun 蛋白的表达可能由于连续十天的游泳训练已对纹状体神经元构成一定的刺激效应,使得纹状 体神经元的c-jun蛋白基础表达值上升。此模型运动方式中运动疲劳后12 h是c-jun蛋白表 达的最高峰,24 h部分层面的某些区域有降低,但仍显著高于即刻,即运动应激引起的c-ju n蛋白表达逐渐减弱,反应存在一定的时效性。

3.3 运动疲劳后纹状体c-jun蛋白表达时效差异的机制 疲劳作 为 一种应激源,通过机体的神经传导链引起神经元的兴奋而释放神经递质(或激素),这些神 经递质作为第一信使,作用于靶细胞的细胞膜,激活胞内第二信使[11],如 cAMP、甘油二脂和Ca2+等,同时诱导IEG的转录和表达。运动疲劳引起DA的释放,可 激活DA受体,通过cAMP途径激活蛋白激酶(protein kinase A , PKA)。PKA功能亚单位进入 细胞核内,使转录因子cAMP反应成分结合蛋白(cAMP response element-binding protein ,CREB)磷酸化进一步调节其下游转录因子c-jun活性[12]。因此激活DA受体cAMP- PKA-CREB通路可能是运动疲劳引起c-jun表达的机制之一。

另外,运动还有可能使得脑细胞内钙离子浓度升高,IEG基因上端调控序列含有钙反应 元素转录调控元素,可调节其表达[13]。高浓度钙离子与钙调蛋白结合形成复合物 ,也可对CREB进行磷酸化修饰,引起c-jun蛋白的表达[14]。c-jun蛋白在外周刺激 条件下,可引起细胞膜电压依赖性Ca2+通道开放,使Ca2+进入细胞内,引起神 经元c-jun原癌基因c-jun mRNA表达增强生成c-jun蛋白[15]。运动疲劳后纹状体钙 离子浓度发生变化,也可能是诱导c-jun蛋白表达增强的原因之一。

4 小 结

运动疲劳后12 h c-jun阳性神经元的表达较对照组均有不同程度的升高,24 h时虽有部分 区域表达降低,但仍显著高于对照及运动后即刻组;中间层面和近尾侧层面中的腹内侧和背 外侧区域是运动疲劳后纹状体c-jun蛋白的高表达区;纹状体的这些区域主要接受黑质DA能 神经投射,说明黑质纹状体DA系统在运动疲劳后纹状体神经元电变化中起重要的调节作用。

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