脐血单个核细胞体外定向分化为神经干细胞及其致瘤性的实验研究

(第三军医大学大坪医院野战外科研究所神经内科，重庆400042)

摘要：目的：探讨人脐血单个核细胞的分离培养和诱导后神经干细胞标志物mRNA的表达，并观察其致瘤性。方法：使用密度梯度离心法得到脐血单个核细胞，用体外贴壁生长的方法获得脐血间质干细胞(MSCs)。观察培养过程中脐血MSCs形态的变化，通过流式细胞仪检测干细胞表面抗原的表达。使用NGF和RA联合诱导后，用RT―PCR方法鉴定诱导前后神经干细胞(NSCs)标志物巢蛋白(Nestin)及Musashi-1蛋白mRNA的表达；收集培养后7d的MSCs，接种于裸鼠皮下，观察是否有增生物的出现，并观察细胞组织形态学变化。结果：脐血单个核细胞贴壁生长后大部分细胞呈梭形，诱导后可分化为神经元样细胞。流式细胞仪检测该细胞不表达CD34，CDlla和CD11b，强表达CD29，符合MSCs特征。诱导后，NSCs表面标志Nestin及Musshi-1表达明显增强(P＜0.05)，48h达高峰，然后逐渐减弱：细胞接种后12周，在裸鼠皮下不能形成肿瘤，与对照组相比，细胞形态学未出现恶性变化。结论：脐血中存在MSCs。分离后可以体外扩增，诱导后分化为神经元样细胞，并表达NSCs表面标志。在裸鼠体内不具有成瘤性。脐血能够成为NSCs的新来源。

关键词：脐血单个核细胞；神经干细胞；诱导分化；巢蛋白：致瘤性

中图分类号：R741

干细胞是指具有自我更新与多向分化潜能的细胞，它们在细胞疗法、基因治疗、发育学研究、药理及毒理学等研究中己显示出无可比拟的作用和优越性。近年来，神经干细胞fneural stem eells,NSCs)移植治疗中枢神经系统疾病引起人们的普遍关注，在动物实验中获得了较好的疗效，NSCs被认为是治疗神经系统疾病的良好载体。但是，由于来源的局限，NSCs的应用受到限制。成体干细胞是存在于发育成熟个体组织中的可自我更新和分化为原组织所有细胞类型的未分化细胞。根据其发育潜能可分为全能干细胞、多胚层多能干细胞、单胚层多能干细胞和定向专能干细胞。存在于骨髓基质中的间质干细胞(mesenehymal stem cdls,MSCs)是研究最早和最为深入的一类多能干细胞，其来源于发育早期的中胚层和外胚层，具有广泛的分化潜能，已经有多项研究显示，外源骨髓MSCs移植入脑内，可以分化为神经细胞。表达神经元特异性标志蛋白。因为脐带血来源的MSCs和骨髓MScs有极其一致的生物学特性，且易于采集、制备及保存。免疫反应性低，因此可能更易于在临床上使用。本研究结合密度梯度离心和体外贴壁生长的方法得到脐血MSCs，诱导后检测其NSCs标志物Nesfin及Musashi-I的表达情况，并将培养后的脐血MSCs接种于裸鼠皮下，观察脐血MSCs对裸鼠的致瘤性，为应用于组织及其功能修复中提高该细胞的生物安全性提供新的依据。

1．材料和方法

1．1主垂试剂

高糖IMDM培养基(Gibco公司)；胎牛血清(Hyclone公司)；淋巴细胞分层液(Cibco公司)；RNA提取试剂Tfizol(invit-rogen公司)；氯仿、异丙醇为国产分析纯试剂；DEPC水(sigma公司)；RT-PCR试剂盒(大连宝生物公司)；琼脂糖(sigma公司)。

1．2实验方法

1．2．1脐血间质干细胞的体外分离和扩增培养无菌条件下采集健康产妇足月妊娠顺产或剖腹产的婴儿脐带血50～100md肝素抗凝，与0.01moL/pH7.4的PBS按1:1混匀，再与3％的明胶1:1混匀，静置60min沉降红细胞。吸上清离心，弃上清，用PBS制成单细胞悬液，叠加到相对密度1.077的淋巴细胞分离液上，2000dr/min离心20min，取界面层，加PBS制成单细胞悬液，离心洗涤3次，弃上清。所得细胞以1.0x102／cm2(T-25培养瓶)的密度接种于含有15％胎牛血清的IMDM培养液(Hyclone公司，置于37℃、体积分数为5％的cm2、饱和湿度的孵箱内培养，3d后换液，弃去悬浮细胞，贴壁细胞继续培养，用倒置显微镜观察细胞形态的改变并照相。待细胞长到80％融合时，用2.5g/L的胰蛋白酶消化后传代。

收集分离后1h、培养后36、48、72h和5d的细胞，离心洗涤，在显微镜下，台盼蓝染色、计数，调整细胞密度备用。

1．2．2流式细胞仪检测取扩增一代的脐血间质干细胞，PBS洗涤后用2．5 WE的胰蛋白酶消化后制成1:0x106的单细胞悬液，共7管，1号管和2号管为阴性对照，分别加入抗鼠的IgG-FITC和IgG-PE单克隆抗体各5ml，其余5管分别加入抗人的CD34-PE，CD31-FITC，CDl3-PE，CD29-PE，CD44单抗各5m1．室温下孵育20min，流式细胞仪检测。

1．2．3脐血间质干细胞的诱导分化取原代细胞，加入20ng/m1 NGF和RA联合诱导培养，收集诱导前，诱导后36、48、72 h、5d的细胞，调整细胞密度备用。

1．2．4 RNA提取取诱导前，诱导后36、48、72h、5d的细胞各3x106个，融于1 mlTRIZOL试剂中，用吸管反复吹打后室温下孵育5min。加入0.2ml氯仿，剧烈振荡后室温下10min。4℃，12000r/min离心15min后将上层无色液体移入新的EP管中。加入异丙醇，室温下放置10min，4℃，12000r/min离心10min弃去上清。加入75％乙醇，4℃，7500r/min离心5min，弃去上清液，风干，加入DEPC处理的纯净水40μl溶解后，55℃孵育15min。

1．2．5 RT-PCR采用相关软件设计引物，并由赛百盛生物工程公司合成。Nestin上游引物：5TCCTTTGACTTrCCTTGTC―TACCTCC 3，下游引物：5AAATCTGAAACTCAAGCACCA3：Musashi-l上游引物5TAATTCCTGTCCAGCAGTCTC3：下游引物5GAACCATCCCGTCCTGTATCAT3。对所提RNA进行定量，取1μgRNA转录成cDNA，在EP管中先后加入MgCL2×PCR buffer 1μl，RNase free H2O 3.75μl，dNTP lμ，RNase inhibor0.25μl，AMV逆转录酶0.5μl，oli-．go-dT接头引物0.5μl，RNA样品1μg，按照如下条件进行逆转录反应30℃10min，48℃50min，99℃5min，50℃5min。合成的cDNA进行PCR扩增。在EP管中依次加入下列物质：Taq酶0.25μl，10xPCR buffer10μl，纯净水27.75μl，

特异性上下游引物各0.5μl。内对照GAPDH上下游引物各0.5μl(30 μmol/L)，cDNA产物10μl，按照以下条件进行PCR反应。94℃预变性5min，94℃30s，57℃30s，72℃30s，30个循环后，72℃延伸7min。取5μlPCR扩增产物加样至含溴化乙锭(EB)20g/l的琼脂糖凝胶中，在5V/cm下电泳60min，紫外透视仪下观察结果，并用凝胶扫描成像系统照相，PCR定量分析软件进行分析。

1．2．6致瘤性取18只BALB/C裸鼠，随机分为3组，背部皮下组、颈部皮下组、对照组各6只。收集培养7d的MSCs，用PBS重悬并调整细胞密度为1x107/ml，非麻醉状态下，于裸鼠背部及颈部皮下分别无菌注射细胞悬液0.5ml，每只各4点．注入生理盐水作为对照组。定期观察，于3d、2周和8周取材，制作冰冻切片，HE染色，镜下观察。之后继续观察裸鼠生长情况至12周。

1．3统计学方法

数据以x＋s表示。采用SPSSl2.0软件对数据进行重复测量数据的分析，显著性水准取α=0.05。

2．结果

2．1脐血单个核细胞体外分离、培养后形态改变

培养前，脐血单个核细胞胞体较小，呈大小均一的圆形，直径约17μm，颜色较深，住高倍镜下可见其不停振动；培养后，细胞胞体增大，有破骨样细胞和梭形细胞两种形态。破骨样细胞胞体较大，呈圆形，多个核。梭形细胞大小不等。形态类似于骨髓MSCs，但较骨髓MSCs稍小。随着时间的推移，破骨样细胞减少而梭形细胞增多，即所需要的间质干细胞

2．2脐血干细胞的鉴定

流式细胞仪检测显示，扩增后的脐血MSCs既不表达造血干细胞的特异性表面标志CD34，也不表达内皮细胞的表面标志CD31，而CD29，CDl3，CD44等间质干细胞的表面标志均为阳性。这表明脐血MSCs是脐血中一群区别于造血细胞的处于未分化状态的非定向干细胞。

2．3诱导后NSCs标志物的表达

Nestin和Musashi-1作为NSCs的标志物已经得到广泛应用。通过RT-PCR检测诱导后这两个基因的表达，使用PCR定量分析软件，分析各样本的PCR光密度。将各样本的PCR光密度值除以内参GAPDH的PCR平均光密度值，重复测量5次。结果发现Nestin RNA在诱导前细胞中低表达，诱导后36h逐渐升高(p＜0.05)，72h后开始降低(p＜0.05)：Musashi-1RNA在诱导前细胞中低表达，诱导后48h呈高表达(P＜0.05)。

2．4致瘤性

于注射后3d、2周和8周取材，肉眼观察裸鼠背部无明显增生物形成。组织学观察接种3d局部有细胞团块存在，团块中心细胞部分坏死。2周时，细胞团块不明显，大部分细胞被吸收。8周时，接种区组织结构与未接种区无明显区别。裸鼠存活12周以上，未见有肿瘤形成。与对照组比较，生长情况与皮肤状况无明显差别。

3．讨论

NSCs具有自我更新和多分化潜能，为神经系统疾病如帕金森病、阿尔海默病、卒中的功能重建带来了希望。无论是作为脑组织移植的供体，还是作为体内诱导分化的靶细胞，NSCs都为中枢神经系统功能重建和神经再生提供了一条新的途径。但NSCs来源有限，不适于展开大规模临床应用。如何获取大量的NSC供临床使用已成为当今干细胞研究的热点和难点。近年发现骨髓MSCs和造血干细胞(hematopoldie stem cells，HSCs)可分化成神经细胞。由于脐血MSCs和骨髓MSCs有极其一致的生物学特性，脐血中的干细胞可能更原始，增殖分化能力更强；而且脐血来源广泛、取材方便，所含有的干细胞数量更多。因此使用脐血干细胞定向诱导分化为NSCs用于临床研究有广阔的应前景。

目前国内外学者已经使用多种方法从脐血中分离干细胞，最常用的方法是利用脐血干细胞体外贴壁生长的特性，将其从造血系统细胞中分离。此外，还可利用密度梯度离心、流式细胞仪分离法和免疫磁珠等方法。最近，有学者采用负极免疫筛选及限制性稀释的方法，分离得到脐血干细胞，使用流式细胞仪和免疫磁珠分离干细胞，操作方法复杂，花费高昂而且实验条件要求高。本实验结合使用密度梯度离心和体外贴壁生长的方法获得脐血MSCs，简单有效，成本低廉，对细胞损伤小，既适合各级实验室进行基础研究，也适合大规模将脐血细胞分离纯化，用于脐血干细胞建库㈣，应用于临床。

成功分离脐血干细胞后，使用NGF和RA联合诱导培养，用RT-PCR和免疫组织化学法检测神经干细胞表面标志物巢蛋白(Nestin)和Musashi的表达。NeSin最早由Lendahl等发现，其表达始于神经胚形成时，当神经细胞迁移基本完成后，巢蛋白的表达量逐渐减少，并随神经细胞分化的完成而停止表达。此外，Sakakibara等亦鉴定出一种RNA结合蛋白Musashi，作为神经干细胞的标志物，Nestin和Musashi作为早期原始神经细胞的标志物已被广泛地应用于NSCs的鉴定。本研究发现新鲜分离的脐血干细胞弱表达Nestin.不表达Musashi-I；诱导后，脐血干细胞的Nestin和Musashi-1表达域逐渐增强，48 h达到最强，进而逐渐减少。这表明脐血细胞具有向神经细胞分化的潜能。

有报道其他祖细胞也能表达Nestin，但多短暂l如，本实验中新鲜分离的脐血干细胞中能够表达Nestin，而诱导后表达明显增强，强烈提示脐血干细胞能够分化为神经干细胞。从胚胎学角度看，脐血中细胞和大脑发育可能有一定的关联。Mezey等发现在大脑发育和生长的过程中血液中的细胞可能持续进入室管膜区和室管膜下区，产生一系列的神经干细胞。Boya等发现脑中的微神经胶质细胞可能来源于造血细胞。Kopen等发现注射人新生小鼠大脑的骨髓干细胞可以趋化至前脑和小脑，分化为星形胶质细胞。Amer-Wahlin等发现脐血中神经元烯醇酶显著高于成年后外周血，提示脐血中细胞有很强的向神经元分化的能力。本文实验同样支持在出生后血液中的干细胞有可能进入大脑，成为NSCs的来源。

MSCS是一类特殊的多能干细胞，在一定的诱导因素下，可定向分化为神经细胞、成纤维细胞、软骨细胞等。但因细胞旺盛增殖，在其自我更新及多向分化时也可能出现永生化现象，在动物体内出现过度生长，导致肿瘤形成。本实验发现，脐血MSCs虽然也处于较旺盛的增殖状态，但接种于裸鼠背部及颈部皮下后，观察12周后无一例出现皮下增生物，其接种部位皮肤组织形态学也无恶性改变。提示脐血MSCs在裸鼠体内不具有成瘤性。本结果将为该细胞的深入研究和未来的应用提供良好的实验依据。当然，关于脐血安全性的研究也才刚刚起步，如何提高其在动物实验及临床应用中分化为功能细胞的生物安全性还需进一步深入研究。