艾比湖湿地土壤纤维素降解菌筛选及酶活测定

摘要：筛选了采自新疆艾比湖湿地的土壤中的纤维素降解菌，并测定了其中具有较高降解效率的8株菌的纤维素酶活。结果表明：经过初筛分离纯化后，共得到纤维素降解菌74株菌，属26个种，筛到的厚壁菌门Firmicutes 芽孢杆菌属Bacillus 细菌最多，有14个种，菌株13C12（Bacillus aquimaris）的纤维素酶活最高，滤纸酶（FPase）活为21.4 U/mL，内切葡聚糖酶酶活达37.4 U/mL，外切葡聚糖酶（Avicelase）为19.2 U/mL，β-葡萄糖苷酶酶活为24.6 U/mL，Bacillus aquimaris可尝试作为工业产酶菌株进行后续试验。

关键词：艾比湖；纤维素降解菌；酶活；Bacillus aquimaris菌株

中图分类号：S182

文献标识码：A 文章编号：16749944（2017）10011304

1 引言

新疆艾比湖湿地部级自然保护区是中国内陆荒漠物种最为丰富的区域之一，由于其特殊的地理位置，使得该地形成了沼泽、滩涂、盐湖、沙漠、石漠、砾漠、盐漠等多种土壤类型。依此而生的土壤微生物资源经历了长期的进化演变，成为我国干旱区重要的种质基因库，具有典型性和较高的保护价值[1]。纤维素是地球上最丰富的碳质资源之一，由于难以被大量分解利用，而被人们大量堆积或燃烧，从而对环境造成极大的污染和资源浪费。如果能通过纤维素水解酶转化利用，必将产生很好的经济和社会效益[2]。纤维素酶是由一系列酶系组成，滤纸是纯纤维素材料，其聚合度和结晶度都比较适中，降解滤纸的滤纸酶（FPase）活性所代表的是纤维素酶的总活力，体现了纤维素酶系内的协同能力。滤纸酶活力的测定主要依据纤维素酶水解滤纸产生还原糖的数量[3]。研究中试图通过分离和筛选具有较高纤维素酶活性的菌株，为开发具有应用前景的工业菌种做出贡献。

2 材料与方法

2.1 供试土壤

试验土壤采自新疆北部艾比湖湿地部级自然保护区内的芦苇地和红柳地。采取距表层0～20 cm土壤约200 g，去除土壤中可见的动植物残体和石子，用自封袋封装带回实验室，过2 mm筛，立即进行筛菌测酶活。

2.2 实验方法

2.2.1 纤维素降解菌筛选

称取1.0 g 土样到10 mL离心管中，加入无菌水9.0 mL 和几粒无菌钢珠，经高速振荡混匀后静置，取上清液1 mL稀释至10-3、10-4、10-5、10-6、10-7五个浓度梯度。取100 μL涂布于培养基上，30℃ 恒温倒置培养24 h后，用牙签挑取形态有差异的单菌落，接种到固体平板培养基上，用于纯化后测序鉴定。

另取上清液1 mL加入液体培养基中，恒温摇床120转/min，30℃富集三代后，划线接种在固体培养基上，24 h后，用牙签挑取形态有差异的单菌落（产外切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶的菌落有透明水解圈，产β-葡萄糖苷酶的菌落周围有黑圈），接种到固体平板培养基上，用于纯化后测序鉴定。

注意：液体培养基不加显色剂和琼脂。

2.2.2 纤维素酶活测定

（1）滤纸酶（FPase）。取100±0.5 mg滤纸与1 mL菌液于10 mL比色管中，加入pH值为4.8，0.1 mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液l mL，50℃水浴酶解反应1 h后取出，迅速冷却至室温。

（2）内切β-1.4-葡聚糖酶（CMCase）。取2 mL CMC-Na溶液与1 mL菌液于10 mL比色管中，50 ℃水浴酶解反应1 h后取出，迅速冷却至室温。

（3）外切β-1.4-葡聚糖酶（Avicelase）。取2 mL微晶纤维素溶液与1 mL菌液于10 mL比色管中，50 ℃水浴酶解反应1 h后取出，迅速冷却至室温。

（4）β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase）。取2 mL水杨苷溶液与1 mL菌液于10 mL比色管中，50 ℃水浴酶解反应1 h后取出，迅速冷却至室温[4]。

酶促反应结束之后，立即加入0.8 mL DNS 试剂，沸水浴5 min之后取出，迅速冷却至室温，用水定容10 mL。在530 nm波长处测定吸光度OD 值，对照葡萄糖标准曲线计算葡萄糖量P。以高温灭活的粗酶液为对照组。

葡萄糖标准曲线绘制：取10 mL比色管6支，加入1.0 mg/mL的葡萄糖标准溶液0.0、0.16、0.32、0.48、0.64、0.8 mL，加蒸馏水0.8、0.64、0.48、0.32、0.16、0.0 mL，加DNS试剂0.8 mL，混匀后煮沸5 min，取出立即用冷水冷却，用水定容至10 mL，摇匀，530 nm测吸光度OD值，以OD值为纵坐标，葡萄糖的含量为横坐标，绘制标准曲线。

酶活定义：底物在一定反应条件（pH值为4.8，50℃，恒温l h）下，与1 mL粗酶液反应1 min生成1 μg葡萄糖为1个酶活单位（U/mL）。

计算：酶活力（U/mL）=P×K×1000/时间*体积，其中K为稀释倍数。

2.3 稻荽理

利用Excel 2003，Origin 8.0和SPSS 17.0对数据进行统计、分析及绘图。重复性实验结果用平均值±标准误表示。

3 结果与分析

3.1 菌株的筛选结果

采用3种培养基和常规的分离技术对土样中的纤维素降解菌进行初步筛选，分离。然后对分离的细菌进行16S rRNA测序，获得序列后，在NCBI进行Blast比对，经过比对的结果如表1。

经过初筛分离纯化后，共得到74株菌，属26个种。筛到的厚壁菌门Firmicutes 芽孢杆菌属Bacillus 细菌最多有14个种。Bacillus是一类好氧或兼性厌氧、能产生抗逆性孢子的杆状细菌。多数为腐生菌，主要分布于土壤、动植物体表及水体中。由于芽孢杆菌属的细菌可以产生多种有用代谢产物，芽孢又是菌体度过不良环境的休眠体，因此，在工、农业生产上有较高的应用价值[5]。例如枯草芽孢杆菌是工业上生产淀粉酶、蛋白酶的主要菌种，苏云金芽孢杆菌用于生产生物农药，巨大芽孢杆菌能提高土壤有效磷的含量等。Bacillus aquimaris能利用羧甲基纤维素钠，水解淀粉，耐盐[6]。Bacillus aryabhattai可以利用纤维二糖，促进植物生长，具有溶磷作用、产植物激素。Bacillus litoralis采自海水淤泥，利用纤维二糖和醋酸纤维素，水解淀粉。Bacillus oceanisediminis具有硝酸盐还原作用，还能利用纤维二糖、醋酸纤维素。Bacillus firmus能富集铬、砷，或用于生物修复[7]。Bacillus vietnamensis中等耐盐、产氧化酶，抗溶菌酶（区别于B.firmus）。可在pH值为4.5和9.0的环境生长，不同于B.aquimaris。Altererythrobacter xinjiangensis能水解酪蛋白和纤维素，可利用葡聚糖。Arthrobacter nicotianae降解尼古丁，脱硫，聚磷。Planococcus rifietoensis产纤维素酶、脱氨酶，促进植物生长（固氮，溶磷作用，产吲哚乙酸）[8]。Microbacterium amylolyticum有一定聚乙烯降解作用。Streptomyces coelicoflavus能降解纤维素，还原硝酸盐[9]。

3.2 纤维素酶酶活测定

选取其中水解圈较大的8株菌进行纤维素酶活测定（表2）。分别测定了滤纸酶（FPase）、内切葡聚糖酶（CMCase）、外切葡聚糖酶（Avicelase）和β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase）的酶活。

由图1可知，菌株13C12、03C5、05B2的滤纸酶活显著高于其它，其中13C12的酶活最高达21.4 U/mL。菌株MZ2、03C9、13C3的酶活次之，约为3.2 U/mL。菌株132和13A4的滤纸酶活最低。

4 结论与讨论

（1）经过初筛分离纯化后，共得纤维素降解菌到74株菌，属26个种。筛到的厚壁菌门Firmicutes 芽孢杆菌属Bacillus 细菌最多，有14个种。

（2）菌株13C12的纤维素酶活最高。滤纸酶（FPase）活为21.4 U/mL，内切葡聚糖酶酶活达37.4 U/mL，外切葡聚糖酶（Avicelase）为19.2 U/mL，β-葡萄糖苷酶酶活为24.6 U/mL。

（3）接种量的多少会影响产纤维素酶菌株在发酵液中的生长、代谢和繁殖速度。选择较大的接种量可以缩短发酵液内菌体密度达到高峰的时间，有利于产物的形成以及培养基质的利用，并减小被杂菌污染的概率。然而接种量过大则会导致发酵液中溶氧不足，限制a物的合成，菌体易老化；接种量过小则会延长发酵周期，影响产率。

（4）由于许多土壤细菌生活力较差，样本采集回来后应尽快筛菌，否则，搁置时间过长会严重影响筛菌的效率和成功率。此外，土壤细菌大多数不可培养，通过传统筛菌方法筛到的菌落有限，所以探寻新的实验方法具有重要意义。

致谢：中国科学院微生物研究所真菌学国家重点实验室周杰民博士对本实验方案设计过程中的支持；感谢新疆生产建设兵团第五师农科所的工作人员在采样过程中的帮助。

参考文献：

[1]

Ma M， Wang X， Veroustraete F， et al. Change in area of Ebinur Lake during the 1998-2005 period[J]. International Journal of Remote Sensing， 2007， 28（24）：5523～5533.

[2]Ding S Y， Xu Q， Crowley M， et al. A biophysical perspective on the cellulosome： new opportunities for biomass conversion.[J]. Current Opinion in Biotechnology， 2008， 19（3）：218～227.

[3]Dashtban M， Maki M， Leung K T， et al. Cellulase activities in biomass conversion： measurement methods and comparison[J]. Critical Reviews in Biotechnology， 2010， 30（4）：302.

[4]Maki M L， Broere M， Leung K T， et al. Characterization of some efficient cellulase producing bacteria isolated from paper mill sludges and organic fertilizers[J]. International Journal of Biochemistry & Molecular Biology， 2011， 2（2）：146～154.

[5]谢长校. Bacillus Ligniniphilus L1降解木质素机理的初步研究[D].镇江：江苏大学，2016.

[6]Trivedi N， Gupta V， Kumar M， et al. Solvent tolerant marine bacterium Bacillus aquimaris secreting organic solvent stable alkaline cellulase[J]. Chemosphere， 2011， 83（5）：706～712.

[7]崔丽娇，王 洁，吕应年，等. 湛江沿海潮间带产胞外纤溶活性酶类海洋真菌的生物多样性分析[J]. 微生物学通报， 2016， 43（7）：1448～1461.

[8]Imran A. Salt-tolerant PGPR strain Planococcus rifietoensis promotes the growth and yield of wheat （Triticum aestivum L.） cultivated in saline soil[J]. Pakistan Journal of Botany， 2013， 45（6）：1955.