食品微生物之水产品中的微生物检验方法研究进展

[摘要] 本文以DNA和免疫学为基础，从免疫磁珠分离法、基因芯片检测法、传统的PCR技术和定量的PCR技术等角度对水产品中微生物的检测方式进行了简单阐述。

[关键词] 水产品；微生物；检测技术

[中图分类号] R254.7 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2013）07-0116-02

Research progress of microbial test method of aquatic product of microorganisms in food

WANG Guoqin

Pingdingshan Center for Disease Control and Prevention in Henan Province， Pingdingshan 467000， China

[Abstract] This article in DNA and immunology as the foundation， from immune magnetic bead separation， using gene chip method， the traditional PCR technology and quantitative PCR technology aspects of microorganisms in aquatic products detecting way briefly elaborated.

[Key words] Aquatic products； Microbial； Detection technology

在水产品当中存在着大量的微生物，对人类的身体健康带来了很大的威胁，会引起腹泻、呕吐、败血症等一系列病症。微生物对水产品的影响是造成食品安全隐患的首要因素。现在对水产品微生物检测方向主要是对大肠杆菌、菌落总数和致病菌等研究[1]。传统的微生物检测方式以分离培养、血清试验和生化技术等为主，但是，面临的主要问题是资金使用大、人工劳动多、效率有待提高、特异性较弱等问题，没能从根本上解决水产品的质量安全，检测力度没有达到标准要求[2]。随着我国分子生物学技术的不断发展，整体的检测效率有了质的飞跃，主要有检测效率高、针对性强、准确性有保证等特点，在对水产品微生物检测方面有着很大的使用前景，并且具有很大的挖掘空间。本文对水产品中微生物的检测方法做一探讨。

1 水产品中微生物的检验方法

1.1 采用免疫磁珠的分离方式

之所以使用免疫磁珠的分离方式，是因为可以将特异性的抗体与磁性颗粒的表面进行关联，可以让样品中的微生物进行特异性的结合，通过外部磁场的影响，装有病毒的微生物磁性球会在其作用之下向两端靠拢，这样就可以使微生物从样品当中脱离出来[3]。

这种方法较普通检测方式而言，有着很明显的优势，可在含有大量细菌的溶液当中具有选择性的将微生物分离出来，并且具有较高的效率。与使用镜检技术和PCR等快速检测方式相互取长补短，免疫磁性分离技术可以将水产品微生物检测效率大大提高。例如：在创建免疫捕获-RT-PCR技术的过程中，即首先使用IgG抗体将甲型肝炎病毒吸收到标本之上，之后把该病毒的RNA通过逆转录形成cDNA[4]。使用PCR技术进行增长扩充，将传统核酸提取方式的步骤进行精简。这种方法体现出的优势在于更加灵敏，可以达到逆转录-PCR技术与打点杂交相结合的效果。把水产品当中的李斯特菌通过免疫磁性分离进行作用，以PCR技术为基础，可以产生具有独特效果的李斯特菌IMS-PCR技术，对水产品进行检测。通过使用该种技术进行检测，我们可以得到如下结论：该方法可以保证食品基质、杂菌和培养及成分不再对PCR检测带来严重性干扰，并且具有高敏感度、高效率和高准确性的特点。

1.2 采用基因芯片检测方式

所谓的基因芯片技术就是把每个基因寡核苷酸放在芯片的表面上，取得微生物样本的DNA，经过PCR扩增之后可以使用荧光标记探针，与芯片表面的寡核苷酸进行点杂交，最后使用精确的扫描仪进行定量并对荧光分布进行分析，最终确定被检测样品当中是否存在某种微生物[5]。基因芯片检测方式可以对微生物进行全面、高效和并行的检测。从数据角度分析，它可以对隐藏的病原体进行检测，使用一张芯片对某一种病原菌的各项指标进行检测，因此具有很好的效果。例如：经过混合之后的基因组可以准确地分辨出各种李斯特菌相关联的分离物，美国科学家经过分析，将单管复合体扩增与基因芯片技术对李斯特菌进行检测和分辨。使用固定、高效的措施对水产品中各种微生物进行获取、处理和分析是我们所期望的。现在，我国虽然在对样品的处理和相关基因芯片技术有了很大程度的提高，但是，使用基因芯片方式还需要对水产品中的微生物进行深入研究，而且要对外部标准化程序、资金、设备和条件等环境进行细致化建设，亟需对这一系列问题给予解决。总而言之，基因芯片技术还有着很大的发展空间。

1.3 采用传统的PCR技术

所谓的PCR技术，就是聚合酶链式反应，它是在上个世纪八十年代首先由美国科学家提出的，是一种可以在体外快速增长的特定基因，所以，又称之为基因体外扩增技术。该技术可以在试管中进行，经过数小时的培养，可以使很少的目标基因增长数十万倍，即把不易检测的皮克单位扩增到易于检测的微克单位，省去了克隆流程，缩减了大量的费时程序。现在，PCR技术已经具有对微生物病原的检测、分析、克隆、分离以及序列分析等功能，而且在水产品微生物检测当中也予以高度的重视。

例如：在辽宁近海地区，大量的海水样品以及贝类中具有甲型肝炎病毒，经过分析研究，使用石英粉滤柱法将水样品进行浓缩，同时使用PCR技术在附近海水中检测出RNA，最终结果表明，该部分海水中存在HAV污染，在此之后，使用抗原捕捉聚合酶链反应技术对辽宁周边沿海城市的水产品进行检测，结果为RNA阳性[6]。麻痹性贝毒是由甲藻类浮游生物分泌出的，对人体神经具有一定的麻痹作用，也是水产品中毒的主要元凶之一。可以通过建立PCR快速检测Alexandrium属和 A.minutum污染贻贝中的相关毒素类型方式，结果得出，PCR是一种对目标浮游生物进行有效深入的检测措施。

1.4 经过改进的PCR技术

新型的PCR技术与传统PCR技术具有相同的原理，但是在定量技术等方面原理有所不同。经过改进的PCR技术是使用荧光染料和探针来确保增长的特异性，而且荧光信号的强与弱直接影响增长产物的多少，以此来确保准确性[7]。采取实时荧光逆转录-PCR方法是在常规逆转录-PCR检测的基础之上使用荧光探针，摒弃了电泳的使用，而且不再使用具有致癌作用的溴化乙锭，这样保证了工作人员、研究人员以及环境的安全性。而且可以进行实时性检测，与其他方法（普通逆转录-PCR、电镜法）相比，更加敏感、特异，并且具有可观的速度。例如：根据副溶血性弧菌的基因为序列设计并合成具有一定特异性的引物和荧光标记探针时，使用定量-PCR技术对虾、鱼片等水产品进行检测，方法是在其中放入副溶血性弧菌，采用直接定量的方式检测出的低限是102 cfu/g。通过24 h的菌类扩增培养，低限可以达到2 cfu/g[8]。

在研究的初期，使用的扩增方式是多重嵌套，在软体动物当中取得DNA部分片段，以PCR增长之后的片段和DNA序列为基础，分析人类粪便中的隐贾第虫和孢子虫的检测结果，在贻贝的DNA中引入两者的基因片段，以此来完成对目标检测基因的建立，之后使用ABC-PCR检测方式，最终表明，这种方法对贝类中隐胞子虫和贾第虫具有很明显的检测效果。

2 结语

综上所述，对水产品中微生物进行安全性检测是极为重要的研究课题，并且更加趋近于实时、准确。通过微生物自身的遗传因子和免疫系统的特点来判断微生物数量的PCR技术、免疫技术和基因技术等都有着使用范围较广的价值，实时处理可以更加准确地进行预防和预报。PCR技术极大地提高了检测效果和灵敏度，但在实际操作当中还是会出现较多的假阳性现象。此外，在外部环境发生极大变化的时候，会产生相应的连锁反应，是灵敏度等优势下降的原因。而基因芯片技术弥补了相关不足，但是整体费用较高，所以，多种方式合理搭配，相信会找到行之有效的检测途径。

[参考文献]

[1] 黄玉柳，陈静，黎小正. 水产品微生物实验室质量控制探讨[J]. 微生物学杂志，2010，30（5）：108-110.

[2] 董成娟. 微生物学检验的影响因素与质量控制[J]. 中国保健营养：临床医学学刊，2010，19（4）：203-204.

[3] 李凤霞，吴燕燕，李来好. 病原微生物对水产品的污染及其检测控制方法[C]. 中国水产学会学术年会论文摘要集，2008，（3）：167-173.

[4] 贾爱荣，孟秀梅，夏雪奎，等. 出口水产品中微生物污染调查分析及限量讨论[J]. 农产品加工·学刊，2012，（1）：24-29.

[5] 刘立志，吴锦如，游鹏. 娄底市水产品微生物污染的实验室检测与分析[J]. 实用预防医学，2009，16（6）：1830-1831.

[6] 胡鲲，李怡，朱泽闻，等. 微生物显色法快速检测水产品中恩诺沙星残留[J]. 上海海洋大学学报，2009，（4）：472-478.

[7] 张振霖. 快速检测水产品中大肠杆菌的新技术研究进展[J]. 中国水产，2008，（7）：78-79.

[8] 林涛，兰敏，黄伟，等. 荧光酶免疫分析仪—微生物鉴定仪在水产品沙门氏菌检测中的应用[J]. 食品与发酵工业，2008，34（8）：133-136.

（收稿日期：2012-11-30）