何首乌致肝损伤大鼠的动态血清代谢组学研究

[摘要]该文采用液相色谱质谱方法测定服用何首乌大鼠的血清代谢指纹谱，同时利用多元统计分析方法比较代谢谱差异并筛查显著相关的生物标志物，考察其动态变化趋势。探讨何首乌致大鼠肝脏损伤的代谢组学动态变化，寻找其显著相关的生物标志物，并考察标志物的动态变化趋势，以期为何首乌致肝损伤的内在机制与临床早期诊断提供依据。结果显示给药后不同时间点大鼠的血清代谢轮廓存在一定的差异，经比较分析，共筛选得到6个潜在生物标志物：oleamide，lysoPC（16∶0），leukotriene A4，transtetradec2enoic acid，dihydrocortisol 和 7ahydroxydehydroepiandrosterone，这些标志物在何首乌致肝损伤动态过程中呈现一定的变化趋势。所筛选到的生物标志物在给药1周后含量即出现明显变化，相比于ALT，AST来说更加敏感。一定程度上可揭示出何首乌造成肝损伤的动态机制以及肝脏自我修复表现，对于监测服用何首乌患者肝功能、早期发现何首乌肝损伤具有潜在的应用价值和意义。

[关键词]何首乌； 肝损伤； 代谢组学； 动态变化； 早期诊断； 内在机制

近年来，中药引发的肝损伤事件较为频繁，尤其是一些传统不认为是有毒的中药如何首乌、决明子、大黄、柴胡、麻黄等的肝毒性问题日益突出[12]。何首乌始载于《开宝本草》，生何首乌性平，味甘、苦，归心、肝、大肠经；具有解毒、消痈、截疟、润肠通便的功效。制何首乌性微温，味甘、涩，归肝、肾经；具有补肝肾、益精血、乌须发、强筋骨、化浊降脂等功效，含有二苯乙烯苷、蒽醌、鞣质、磷脂和多糖等多种化学成分[3]。何首乌是传统补益类中药，与人参、灵芝和冬虫夏草并列为祖国“四大仙草”。而关于何首乌肝毒性的频发趋势更是愈演愈烈，检索知网数据库2005年至2014年10年间共有183例关于何首乌肝毒性的报道。近年来，国内外不断有文献报道因服用生、制何首乌或含何首乌相关制剂而导致黄疸、肝炎和肝功能异常等患者[45]。以至于2014年度国家食品药品监督管理总局药品不良反应中心公开通报口服何首乌及其成方制剂引起的肝损伤风险，并要求相关厂家根据品种实际和不良反应监测情况完善药品说明书的安全性信息等。

然而，何首乌致肝损伤的机制目前尚不明确，对其引发肝损伤的动态过程也缺乏有效的数据，因此导致临床上辨识和诊断较为困难。课题组前期对何首乌致肝损伤进行了系列研究，临床流行病学数据调查结果显示，何首乌致肝损伤与患者服药剂量、时间、性别、年龄均缺少明确的对应关系，具有特异质属性[6]，同时发现何首乌本身也存在潜在肝毒性，为了充分暴露何首乌潜在毒性，前期课题组采用大剂量何首乌醇提物，考察其对大鼠多K器的损伤作用，结果从组织病理上可以看出何首乌大剂量提取物对肝脏有明显的损伤作用，但临床常用的ALT，AST转氨酶指标并无显著变化[7]。鉴于此，本文采用课题组前期实验的血清标本，对何首乌致肝损伤的大鼠进行动态血清代谢组学研究，旨在描述何首乌造成肝损伤的动态过程，运用代谢组学的方法寻找动态变化的生物标志物，初步探讨何首乌致肝损伤的体内代谢机制，以期为临床何首乌肝损伤的动态监测提供一定的依据，为临床何首乌致肝损伤的临床早期诊断提供辅助参考。

1材料与方法

11仪器与试剂高效液相色谱（Agilent 1200 HPLC，美国Agilent公司）四级杆飞行时间串联质谱仪（Bruker microTOFQⅡ，德国Bruker公司），DataAnanlsis 工作站，Gradient A10 MillQ超纯水器（法国Millipore公司），迈瑞BS300全自动生化分析仪（上海富众生物科学有限公司），冷冻离心机（Sigma公司，德国），微量分析天平（Mettler Toledo AL204 瑞士），涡旋混匀器（HYQ 2121A）。生首乌购于北京绿野药业有限公司（批号10050904），经第三二医院肖小河研究员鉴定为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb的干燥块根；甲醇（色谱级，德国Merck公司）；去离子水经（182 MΩ） Millipore MilliQ 系统（Millipore Co，美国） 超纯水器净化，其他试剂均为市售分析纯。谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）检测试剂盒（南京建成科技有限公司）。

12动物SD大鼠，SPF级，体重160 g左右，雄性，共12只，购于军事医学科学院实验动物中心，合格证号SCXK军2007004。动物饲养于屏障动物房，室温（20±2） ℃，相对湿度60%～70%，通风良好、环境安静，室内保持12 h照明，12 h黑暗，并定期消毒。

13试药将生何首乌粉碎得粗粉，加6倍量的75%乙醇冷浸提取，共提取5次，每次48 h，合并醇浸提取液，浓缩并减压干燥，制得干粉备用。每次给药前按配制药液，水浴加热至37 ℃时使用。

14样本收集给药剂量为40 g・kg-1，按每200 g体重5 mL灌胃给药，连续给药28 d（4周）以制备肝损伤大鼠模型。给药期间大鼠自由饮食，每日观察给药前后每只动物的外观体征、行为活动、毛发变化、大小便形状、颜色及有无异常分泌物等。给药期间每7 d大鼠眼眶取血，分离血清后置于-80 ℃冰箱。

15样品预处理与LCMS/MSQTOF检测样品预处理：将大鼠血清于-80 ℃冰箱中取出，复融，取250 μL加入到15 mL EP管中，再加入750 μL的甲醇溶液，混匀，静置，4 ℃下冷冻离心（1万 r・min-1，10 min），取上清，并用022 μm微孔滤膜滤过，备用。

LCMS/MSQTOF检测：采用Agilent ZORBAX SBC18（21 mm×150 mm，5 μm）色谱柱；柱温25 ℃，流速025 mL・min-1，进样量为20 μL，样品温度4 ℃，检测波长420 nm；流动相A：甲醇，流动相B：水；梯度洗脱（0～5 min：甲醇30%～90%；5～51 min：甲醇90%；51～40 min：甲醇90%～30%）；离子源ESI±；毛细管电压3 500V；相对分子质量数50～1 000；碰撞能7 eV；锥孔能5 eV；脱溶剂气流量60 L・min-1；脱溶剂气温度180 ℃。

16数据处理与分析将所测数据采用DataAnalysis和Mzmine软件进行色谱峰识别，再将数据导入SIMCAP 11软件，标准化后进行主成分分析（PCA）和偏最小二乘法判别（PLSDA）分析。运用variable influence in the projection（VIP）方法来预测各个数据对模型的贡献值，VIP>1说明具有明显的贡献，有统计学意义，为可能的潜在标志物。再采用OneWay ANOVA的方法，根据P

2结果

2结果

21何首乌致肝损伤大鼠的动态血清PCA主成分分析本实验连续给药4周，经PCA分析各周大鼠的血清代谢物，结果表明：从第1周到第4周，大鼠血清代谢物呈现顺时针的变化趋势，也就是说何首乌扰乱了大鼠的体内代谢平衡，从第1周的轻微扰乱到第4周的严重扰乱，同时也体现出大鼠体内生物代谢发生紊乱，从而反映到代谢物的不断变化水平上。

22何首乌致肝损伤大鼠的动态血清PLSDA分析为了进一步阐明何首乌肝损伤大鼠血清代谢物的变化，本文在PCA模型基础上拟合偏最小二乘法判别分析（PLSDA）模型，旨在发现各周大鼠血清之间的差异，以寻找引起肝损伤变化的因素。PLSDA分析也表明各周大鼠血清的代谢物呈现一定的变化趋势，同时也反映出何首乌肝损伤大鼠体内代谢的紊乱程度以及变化情况。从载荷图中可以看出：图中每一个“”代表一种代谢给药1周后；给药2周后；给药3周后；*给药4周后。

物，其距离中心越远，说明该代谢物在各周大鼠中的差异性越大，也就是说此代谢物可能是何首乌导致大鼠发生肝损伤的生物标志物，其随着肝损伤的不断恶化而相应改变，在微观水平上体现何首乌肝损伤大鼠体内代谢的紊乱以及变化趋势；再者，通过结合VIP变量权重分析，可以看出大鼠血清中的生物标志物的变量权重，变量权重越大，说明该标志物在各周大鼠血清之间的差异性也越大（图4）。一般意义上认为VIP>1为具有统计学意义，说明该物质对模型的构建具有显著的贡献。本文则选取VIP>2的物质作为潜在的生物标志物，旨在发现与何首乌致肝损伤大鼠动态血清变化高度相关的生物标志物，同时也探索与肝损伤严重程度高度相关的生物标志物。图2何首乌致肝损伤大鼠的动态血清PLSDA分析

23何首乌致肝损伤大鼠的动态血清生物标志物筛查通过检索人类代谢物数据库（HMDB），发现与何首乌肝p伤大鼠动态血清变化（1～4周）内显著相关的6个生物标志物，具体为oleamide，lysoPC（16∶0），leukotriene A4，transtetradec2enoic acid，dihydrocortisol 和 7ahydroxydehydroepiandrosterone。这6个生物标志物的VIP值均在20以上，且在各周大鼠的血清中呈现一定的变化趋势（表1）。如oleamide在第1周时含量最高，但从第2周时开始迅速下降；lysoPC（16∶0）从第2周时迅速升高，第3周时则出现明显下降，第4周仍处于下降趋势（图5）。由此可见，何首乌致肝损伤大鼠在第1周到第4周时其中的标志物呈现一定的变化趋势。

3讨论

本实验结果表明，何首乌在引发大鼠肝损伤的过程中血清代谢物呈现一定的变化趋势，但是常规肝功指标ALT和AST对于何首乌引发的肝损伤不敏感，本实验中大鼠分别给予何首乌4周后ALT和AST未见明显升高，而仅在第3天生首乌组一过性升高[7]，ALT和AST对何首乌引发的肝损伤不敏感，无法进行早期监测。而本文动态代谢组学研究表1何首乌致肝损伤大鼠动态血清生物标志物筛查

结果表明在第2周时大鼠体内即发生轻微程度的代谢紊乱，体内代谢物对何首乌肝损伤的敏感性高于临床常用的ALT和AST肝功能生化指标。

同时本文对何首乌造成大鼠肝损伤的1～4周进行动态血清代谢组学监测，结合多维统计学方法筛选出高度相关的6个生物标志物，分别为oleamide，lysoPC（16∶0），leukotriene A4，transtetradec2enoic acid，dihydrocortisol和7ahydroxydehydroepiandrosterone，这些标志物在肝损伤动态期间也呈现一定的变化趋势。其中，oleamide（油酸酰胺）属于脂肪酸，作为动物体内的一种内源性物质，参与体内的神经递质系统发挥受体激动作用。有关研究表明[89]：oleamide在乙型肝炎病毒导致的肝癌患者的肝脏组织中含量相比于正常人群显著降低，但是在酒精性肝硬化患者中则显著升高。而该文研究也表明oleamide在何首乌致大鼠肝损伤的动态过程中呈现总体下降的趋势，其可作为体现肝脏病变的重要标志物。lysoPC（16∶0）是一种溶血卵磷脂，是构成生物膜的重要组分，起到细胞内外物质交换的作用。Chamulitrat等研究发现四氯化碳诱导的急性肝损伤模型中肝脏的卵磷脂合成也受到抑制[10]，而溶血卵磷脂作为卵磷脂的亚型，当肝脏受到损伤时体内的溶血卵磷脂也会发生一定程度的紊乱。leukotriene A4（白三烯A4）可参与宿主防御反应、直接过敏及炎症相关反应，是花生四烯酸代谢的中间体。其在体内的生物合成与催化主要位于肝脏细胞的微粒体中[11]，一旦肝脏受到损伤，其含量水平必然会发生异常。transtetradec2enoic acid是体内肝脏合成脂肪酸的中间体，至今为止尚未发现其与肝损伤有关的相关报道，本研究是首次发现该标志物与何首乌造成的肝损伤密切相关。dihydrocortisol是胆汁酸合成的中间体、甾体激素代谢以及P450代谢的重要组分，至今也未有其与肝损伤相关的报道。7ahydroxydehydroepiandrosterone是肝脏P450酶催化脱氢表雄酮的主要代谢物[12]，有研究表明[13]其是体内调节糖皮质激素水平的重要物质。