单分子检测技术及其在人涎腺肿瘤实验性转移中的应用

[摘要]单分子检测技术是对宏观表象本质进行直接探索的一种方法，其检测空间尺度可至纳米数量级，考察异质群体中的每个个体，并鉴定、分类、定量比较它们的亚群。单分子检测技术可以用来检测生物系统中小概率事件或数目较少的目标分子。本文以全内反射荧光显微术为例概述单分子检测技术及其在口腔医学中的运用。

[关键词]单分子检测；全内反射荧光显微术；绿色荧光蛋白；实时观测

[中图分类号]R 782[文献标志码]A[doi]10.3969/j.issn.1673-5749.2012.04.026

Single-molecule detection technology and its application of experimental metastasis of human salivary tu－morTian Tian, Li Shu.（Dept. of Periodontics, Stomatological Hospital of Shandong University, Jinan 250012, China; Shandong Provincial Key Laboratory of Oral Biomedicine, Jinan 250012, China）

[Abstract]Single-molecule detection（SMD）directly explores the essence of macro presentation by detect scale of nanometer scalar which can review every unit of the heterogeneous group and identify, classify, measurable compare its subgroups. SMD can sensitively detect small probability event or minority aim molecules of the biology system. This paper reviews total internal reflection fluorescence and applications in the life sciences.

[Key words]single-molecule detection；total internal reflection fluorescence；green fluorescent protein；realtime observation

全内反射荧光显微术（total internal reflection fluorescence，TIRFM）是近年来新兴的一种光学成像技术，可用来实现对单个荧光分子的直接检测。

本文以TIRFM为例，对单分子检测（singlemolecule detection，SMD）技术和光学分子成像技术在人涎腺肿瘤实验性转移中的应用作一综述。

1全内反射荧光显微术

TIRFM[1]利用了全内反射产生的隐失波照明样品，使照明区域限定在样品表面百纳米级厚的薄层范围内，有效控制激发体积，因此具有其他光学成像技术无法比拟的高信噪比和对比度。

至今，TIRFM已广泛用于生命科学研究，特别在SMD中，已成为当今最具前途的生物光学显微技术之一。

1.1全内反射的基本理论

全内反射是一种普遍存在的光学现象，一束平面光波从玻璃表面进入到溶液中，界面上会同时发生反射和折射，并且存在一个临界角。当入射角继续增大到大于临界角时，光不再透射进溶液，即发生了全反射。从几何光学的角度来看，当光发生全反射时，光会在玻璃界面上完全反射而不进入液体溶液中。实际上，由于波动效应，有一部分光线会穿过界面渗透到溶液中，平行于界面传播，这部分光场就是所谓的隐失波。隐失波的频率与入射光线的频率相同，其强度随临界面的垂直距离呈指数衰减。由于隐失波仅沿着临界面极薄的一层范围内传播，所以利用隐失波照明样本，可以仅激发紧贴近盖玻片的一薄层范围（100～300 nm）内的荧光基团，不激发更深层溶液中的荧光基团，因此极大地提高了显微成像的信噪比和对比度，使得所呈图像的分辨率得到了显著改善。

1.2全内反射中的荧光探测

在单分子的荧光探测中，最关键的问题是如何减少背景光的干扰，使单分子的光信号超过背景光信号而被探测到。近年来，探测设备的超灵敏化使得在生理状况下荧光探测生物单分子成为现实。全内反射显微成像是采用隐失波照明的，隐失波的特点是在平行界面方向以行波场方式传播，在垂直界面方向则是一个指数衰减场。所以这种显微成像技术成像的视野开阔，同时探测样品的厚度却很薄，约为百纳米量级，可以将背景光减小到极低的水平。对于生物大分子而言，如蛋白质和核酸，为了加强信号的强度，每一个分子要用很多个相同的荧光团来标记。

1.3TIRFM的应用

1.3.1活细胞中的单分子成像单分子成像技术能够定量检测活细胞内单个信号发放分子的定位、运动、翻转以及复合物的形成等，可作为阐述细胞中信号发放机制的有效方法。TIRFM因其独特的照明方式，背景荧光极低，较之其他生物成像技术而言，在活细胞中的单分子成像中更显优越性。TIRFM单分子成像技术也可用来检测活细胞中绿色荧光蛋白或黄色荧光蛋白标记的蛋白质分子[2]。

1.3.2生物大分子的相互作用TIRFM单分子成像技术可用于监测RNA聚合酶与DNA、葡聚糖与葡糖基转移酶以及其他蛋白质的相互作用[3-4]。此外，Yao等[5]使用TIRFM单分子成像技术，实时监测了在液/固界面上发夹型分子信标DNA探针杂交反应的动力学过程。

1.3.3酶反应3, 4亚甲基二氧基甲基苯丙胺可导致人或动物模型中血清素的长期消耗，降低血清素载体的功能。Kivell等[6]利用TIRFM和活细胞共聚焦显微镜观察到了3, 4亚甲基二氧基甲基苯丙胺作用下，色氨酸转运体从细胞表面到细胞内的再分配过程。

1.3.4离子通道离子通道是一种位于细胞膜上由蛋白质单个分子或分子复合体构成的充满水的微小孔道，它的开放与关闭控制着细胞内外的离子交换。目前，离子通道构象与功能的相互关系的详细机制还不清楚。Ide等[7]将荧光标记的离子通道掺入琼脂包被玻璃上的平板脂质双层中，并用物镜型TIRFM进行观察。该技术与荧光共振能量转移或双屏光学系统结合，能够进一步观察离子通道与其配体的相互作用，也可在体外同时跟踪离子通道的构象变化和离子电流。

1.3.5DNA转录近年来，TIRFM被用于直接观察基因的表达过程[8-9]。研究人员将单RNA聚合酶分子进行荧光标记，观察到了其在DNA表面的滑动运动，这为寻找启动基因的滑动机制提供了直接证据。当RNA聚合酶与DNA的启动基因结合时，转录过程就开始了。

2分子光学成像在人涎腺肿瘤实验性转移中的应用

肿瘤本身具有病因多样复杂、病程长短不一、症状表现各异、易于扩散转移以及死亡率高等特点，因此，对实验动物肿瘤模型的应用和需求比一般疾病更多、更全面。利用免疫缺陷动物建立人体肿瘤的高转移模型，是研究肿瘤转移机制和抗转移治疗的重要实验工具，国内外学者在这方做了大量研究和探索，但理想的转移模型并不多。

转移是恶性肿瘤的生物学特性之一，是绝大多数肿瘤患者治疗失败和死亡的主要原因之一。通过复制人类肿瘤动物模型，可研究肿瘤的发生发展过程并阐明肿瘤的转移机制。目前肿瘤转移模型主要有两种[10]：自发转移模型和实验转移模型。近年来，分子成像技术的发展使得对小动物肿瘤模型实时非侵入活体成像已成为可能[11]。其中光学成像具有许多优点：非电离低能量照射、高灵敏度、无放射试剂、成像系统费用低[12]，这些都适用于小动物肿瘤研究。绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）作为新一代报告基因，已经广泛应用于生物医学的各个领域。基于GFP的活体荧光成像可用于发现肿瘤发生发展的细胞和分子机制，并进行非侵入性活体评价抗肿瘤药物的疗效[13]。Yang等[14]利用整体光学成像系统对表达GFP的肿瘤进行了荧光成像，记录了肿瘤转移过程，分辨率可达到单个荧光细胞。他们同时建立了多种荧光蛋白标记的肿瘤模型，通过监测荧光强度反映了肿瘤的大小和位置，并对肿瘤的生长、转移和消退等特性进行了活体研究。这在一定程度上实现了对肿瘤治疗效应的活体监测和评价。整体光学成像是一种非侵入的外部成像技术，对软组织器官和骨转移癌的检测非常灵敏和快速。目前，已建立了肺癌、黑色素瘤、结肠癌等多个原位GFP肿瘤的整体荧光成像的动物模型，并利用其进行抗肿瘤生长、转移和血管生成的活体药物的筛选和评价[15]。

国内在此方面的研究内容集中于肿瘤生长，少见相关转移的报道。金鹰等[16]利用整体光学成像系统对GFP标记的皮下肿瘤进行了简单观察，但其并没报道皮下肿瘤连续生长过程中的荧光图像。熊涛[17]通过脂质体转染和细胞筛选，成功建立了表达增强型GFP的人涎腺癌细胞株，为研究肿瘤光学成像提供了内源性的光学信号。建立了GFP标记肿瘤的尾静脉注射实验转移模型以及原位种植转移模型，并对模型动物进行了整体荧光成像研究。整体荧光成像系统对裸鼠直接行荧光成像，并且实时非侵入地记录了涎腺肿瘤生长和转移的过程。实验中对5只原位注射了人涎腺癌细胞的裸鼠进行胸腔解剖观察发现，其中4只的肺部可获得清晰的GFP荧光图像，同时还观察到原位肿瘤转移至骨骼和膀胱处。

3展望

随着SMD研究的飞速发展，人们已将研究方法从宏观的统计分析扩展到对微观个体的离散研究，将研究对象从简单体系推广到复杂生物体系，力图在分子水平上阐述蛋白质、DNA等生物分子的结构与功能的关系等问题。如何实现对活细胞或体内环境的实时观测，是单分子成像研究的热点。

4参考文献

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