全脑缺血再灌注损伤后ERK在大鼠海马的表达及热休克预处理对其表达的影响

【关键词】 脑缺血；再灌注损伤；热休克预处理；细胞外信号调节MAP激酶类

Expression of ERK in rat hippocampus after global cerebral ischemia/reperfusion and effect of heat shock preconditioning on it

【Abstract】 AIM: To investigate the expression of ERK in hippocampus of SD rats after global cerebral ischemia/reperfusion and the effect of heat shock preconditioning on it, and to clarify the role of ERK in global cerebral ischemia/reperfusion injury. METHODS: Ninety healthy male SD rats were divided into 3 groups randomly: sham operation group (SO group, n=30), ischemia/reperfusion group (IR group, n=30) and heat shock preconditioning group (HSP group, n=30). Global cerebral ischemia/reperfusion model was produced by 4VO method. The rats were put in 42℃ for 15 min as heat shock preconditioning, then subjected to 6 min ischemia followed by 2, 6, 12, 24 h, 3, 5 d reperfusion, and all rats were executed at corresponding time points. HE staining, immunohistochemical staining and TUNEL staining of brain tissue section were performed. RESULTS: In CA1 of IR group, ERK was expressed 2 h after global cerebral ischemia/reperfusion, peaked at 24 h and still lasted at 5 d. Expression in CA3 was weaker than that in CA1 and cellular damage in CA1 was more obvious. Expression of ERK in CA1 and CA3 of HSP group were weaker than that in IR group at each time points (P<0.05). At the same time, cellular damage was weaker and apoptotic cells decreased(P<0.05). CONCLUSION: Overexpression of ERK after global cerebral ischemia/reperfusion participated in the neuronal injury procedure and heat shock preconditioning exerted its brain protective function through its suppressive effect on the overexpression of ERK.

【Keywords】 brain ischemia; reperfusion injury; heat shock preconditioning; extracellular signalregulated MAP kinases

【摘要】 目的： 研究全脑缺血再灌注损伤后erk在SD大鼠海马的表达及热休克预处理对其表达的影响，以阐明ERK在脑缺血再灌注损伤中作用机制. 方法： 健康雄性SD大鼠90只，随机分为假手术组（SO组，n=30），缺血再灌注组（IR组，n=30），热休克预处理组（HSP组，n=30），以四血管法建立全脑缺血再灌注模型，将大鼠置于42℃中15 min行热休克预处理，全脑缺血6 min后2, 6, 12, 24 h, 3, 5 d再灌注后处死，取海马组织行HE染色，ERK免疫组化染色，TUNEL法检测凋亡细胞. 结果： IR缺血再灌注后2 h ERK在CA1区开始表达，24 h达到高峰，5 d仍有表达，CA3区弱于CA1区，同时CA1区细胞损伤明显，HSP组ERK在CA1和CA3区相应时点均弱于IR组（P<0.05），细胞损伤轻微，凋亡细胞减少（P<0.05）. 结论： 全脑缺血再灌注损伤后ERK过度表达参与了神经元损伤过程，热休克预处理通过下调ERK过度表达具有脑保护作用.

【关键词】 脑缺血；再灌注损伤；热休克预处理；细胞外信号调节MAP激酶类

0引言

近来研究发现，脑血流中断和再灌注使脑组织细胞产生损伤级联反应至少涉及4个不同机制：能量障碍、兴奋性氨基酸毒性、梗死周围去极化、炎症及程序性细胞死亡，上述机制均与信号通路调节有关［1］. 丝裂素活化蛋白激酶（MAPK）家族成员是连接细胞膜表面受体与决定性基因表达之间重要调节酶，但对其成员之一ERK1/2（细胞外信号调节激酶）在脑缺血再灌注损伤中作用的研究结果却相互矛盾，热休克预处理可通过诱发产生热休克蛋白而具有脑保护作用［2］，因此我们观察SD大鼠全脑缺血再灌注损伤后ERK蛋白在海马的表达及热休克预处理对其表达的影响，以阐明ERK在全脑缺血再灌注损伤中的作用机制.

1材料和方法

1.1材料健康雄性SD大鼠90只，由西安交通大学医学院动物中心提供，鼠龄50~60 d，体质量(300±12) g，随机分为3组，假手术组（SO, n=30），缺血再灌注组（IR, n=30）和热休克预处理组（HSP, n=30），各组6个时间段每时段5只. TUNEL试剂盒购自德国宝灵曼公司，ERK多克隆兔抗鼠抗体及辣根酶标记链霉卵白素试剂盒由美国Santa Gruz Bioteohnolgy公司生产.

1.2方法

1.2.1动物模型制备所有动物均以20 g/L戊巴比妥钠40 mg/kg行腹腔内注射麻醉，待翻正反射消失后俯卧固定于手术台上，在大鼠枕颈正中切开皮肤显露枕后三角，在显微镜下于枕后三角外侧与第一横突之间找到椎动脉博动后，以25 mV电凝器凝断双侧椎动脉，逐层缝合，术毕回笼，使其体温维持37℃左右. 24 h后以同样方法麻醉，在胸锁乳突肌后气管旁，显露颈总动脉，用无创动脉夹同时夹闭6 min，期间密切观察其瞳孔变化，无瞳孔散大者予以剔除，逐层缝合后回笼. 给予2, 6, 12, 24 h, 3, 5 d再灌注后处死. HSP组： 将SD大鼠置于可控温箱中42℃ 15 min，于24 h后和IR组同样处理. SO组： 除不凝断椎动脉和夹闭颈总动脉外，其他处理同IR组.

1.2.2组织学检查到要求时间时麻醉后于剑突下横向剪开腹壁显露膈肌，将其沿胸壁左右向剪开，将胸前壁离断掀起，显露心脏，用9号针从心尖插入心室，剪开右心房，先用生理盐水然后再用4 g/L多聚甲醛200 mL灌注至肝脏变白、四肢僵硬，断头取脑，在视交叉后1 mm及4 mm处冠状切面切开，取中间块，固定后石蜡包埋，在海马齿状回互包平面连续冠状切片，片厚4 μm. 行HE染色，光镜下观察SD大鼠海马CA1，CA3区细胞形态学变化，采用TUNEL法原位检测凋亡细胞，显示细胞核有明显的黄棕色颗粒或斑片为阳性细胞，即凋亡细胞，定量分析方法为： 光镜下计算凋亡指数. 凋亡指数（apoptosis index, AI）计算方法： 每只动物随机两张切片，每张切片观察CA1或CA3区，分别计算各区凋亡细胞数和总细胞数. AI=凋亡细胞数/总细胞数×100%.

1.2.3免疫组织化学将切片脱蜡，微波修复抗原，置入30 mL/L H2O2室温下孵育10 min，滴加正常山羊血清封闭液，室温10 min，滴加ERK多克隆抗体，为浓缩一抗，使用时用PBS稀释为1∶50进行滴定，滴加辣根酶标记链霉卵白素，37℃孵育30 min, DAB显色试剂显色. 组织切片中显示细胞浆或细胞核有明显黄棕色颗粒或斑片为ERK阳性.

1.2.4灰度测定及结果判断采用德国LeicaQ550E高清晰彩色图文分析计算机系统对阳性结果进行半定量测定，将摄影机镜头随机选取被测视野，显示于高分辨监测仪上，在此视野中按颜色监测阳性物质. 把选出阳性物质赋予棕黄色，得出二值图，并测出灰度，每只动物选出4张切片，每张切片再随机选取3个视野，测定灰度取平均值.

统计学处理： 所有数据以x±s表示，应用SPSS10.0软件进行方差分析及LSDt检验，P<0.05差异有统计学意义.

2结果

2.1ERK在IR组SD大鼠海马CA1区2 h即有表达，主要位于核膜，12 h出现于核内，24 h达到高峰，5 d时仍有表达；CA3区较CA1区各时点表达弱（P<0.05），6 h出现于核膜上，12 h出现于核内，24 h至5 d位于胞浆. HSP组各时点于各区表达均弱于IR组（P<0.05，表1）. SO组高倍镜下细胞结构清晰可见，核膜完整，核仁明显. IR组缺血再灌注3 d时细胞间质水肿明显，神经元数目减少，排列紊乱，核膜界线不清，核仁消失，CA3区少数细胞结构不清，HSP组变化不明显.

2.2凋亡细胞IR组于缺血再灌注后24 h即出现凋亡细胞，主要位于CA1区，3 d时达高峰，CA3区于各时点少于CA1区（P<0.05），HSP组于各时点各区凋亡细胞计数少于IR组（P<0.05，表2）.

3讨论

MAPK（丝裂素活化蛋白激酶）家族成员是哺乳动物细胞内一组进化保守的酶，是连接细胞膜表面受体与决定性基因表达间重要凋节酶，其作用涉及多层次的细胞调节，对丝裂素、激素、生长因子等生理病理刺激如缺血缺氧等均可作出不同反应，因而调控着细胞的适应，增殖分化、存活和程序性细胞死亡等几乎所有的生理功能和过程，故又有细胞质及细胞核联系枢纽之称. 目前已发现哺乳动物脑细胞组织中有3种MAPK，分别为：细胞外信号调节激酶（ERK1/2），Cjun氨基末端酶（JNK1/2/3），P38 MAPK（P38 α, β, γ）它们被上游激酶激活，经过核转位可激活各自的核内转录因子，再调节转录靶基因，促进有关蛋白的合成及通路的改变，完成对细胞外刺激的反应［3］.

脑缺血再灌注损伤发生后，通过各种细胞膜受体介导，激活PKC途径，AC途径、Ca2+CaM途径，再激活MAPK级联反应的ERK, JNK, P38通路，通过调控凋亡相关基因家族成员的差异性表达及Caspase家族的激活、Fas配体的表达等，参与调控细胞凋亡［4-5］，一般认为ERK通路在促进神经元细胞增殖、分化，抑制凋亡中发挥重要作用［6］，但对脑缺血再灌注损伤后ERK作用的研究结果却相互矛盾. ERK激活后，可降低脑缺血再灌注损伤NMDA受体活性，抑制Ca2+内流，具有神经元保护作用［7-8］；而抑制脑缺血再灌注损伤后ERK1/2表达，可促进短暂局灶脑缺血后神经元的凋亡［8-9］.

表1SD大鼠缺血再灌注后各时点CA1区和CA3区ERK灰度值（略）

aP<0.05 vs假手术, bP<0.05 vs CA1, cP<0.05 vs缺血再灌注.

表2SD大鼠缺血再灌注后各时点CA1区和CA3区凋亡指数（略）

aP<0.05 vs假手术, bP<0.05 vs CA1, cP<0.05 vs缺血再灌注.

我们的实验结果显示，脑缺血再灌注后ERK在SD大鼠海马CA1区表达较CA3区强，同时伴有CA1区神经细胞变性坏死，细胞凋亡，说明ERK的过度表达参与了脑缺血再灌注损伤过程，其机制尚不清楚，可能与增加兴奋性氨基酸释放，从而增加兴奋性毒性致神经元死亡［9］.

热休克预处理对大脑缺血再灌注损伤具有保护作用，其机制为抗氧化调节其他蛋白质合成、维持细胞固有蛋白质形态结构、促进缺损蛋白质的修复、影响糖皮质激素的释放及代谢、干扰宿主的炎症反应对防止细胞凋亡有重要作用［10-11］. 我们的研究结果发现，HSP组ERK在缺血再灌注后各时间点及各区的表达明显弱于IR组，同时细胞损伤及凋亡减弱，说明热休克预处理可下调ERK的表达，保护缺血再灌注损伤后的脑组织.

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