内质网、线粒体与脑缺血再灌注

[摘要] 内质网和线粒体是细胞内合成、分泌、加工和运输蛋白质等物质以及维持机体能量代谢稳定的重要场所，然而在面临创伤、缺血、缺氧等环境因子超负荷作用时，又通过复杂的病理生理过程最终导致细胞凋亡，甚至死亡。脑卒中是临床上的常见病，脑缺血再灌注损伤是影响卒中患者治疗效果的首要因素之一，是医务工作者及患者所共同面临的棘手问题。目前，线粒体和内质网应激途径在诱导细胞凋亡及抗细胞凋亡研究中的地位日趋明显，内质网应激与线粒体通路及其在脑缺血再灌注损伤中的研究具有重要意义。

[关键词] 内质网；应激；线粒体；通路；脑缺血再灌注损伤

[中图分类号] R743.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2013）23-0020-03

缺血/再灌注损伤是指在缺血的基础上恢复血流后组织损伤反而加重、甚至发生不可逆性损伤的现象。自由基作用、细胞内钙超载和白细胞激活是缺血再灌注损伤的重要发病学环节，而细胞凋亡被认为是脑缺血再灌注损伤的主要环节[1]。内质网应激和线粒体通路是生物学界目前阐明得最为清楚的信号通路，也是发展最为迅速的领域。最近研究表明，内质网线粒体耦联结构是内质网和线粒体间的重要连接纽带[2]，通过内质网应激联合线粒体通路的协同效应可诱导神经细胞凋亡，也可发挥神经细胞保护作用[3，4]。现就内质网与线粒体的结构功能及其在脑缺血再灌注损伤中的协同作用研究做一综述。

1 内质网和线粒体的结构与功能

1.1内质网的结构与功能

内质网是一类由大小、形态各异的膜性管、囊泡所构成的连续膜性三维管网状结构的细胞器，与蛋白质的分泌合成、加工修饰及转运过程密切相关，为新生多肽链的正确折叠和装配提供了有利环境。在细胞不同生理功能状态下，内质网的形态结构、数量分布及发达程度都会出现明显的差别，且始终处于一个形态结构不断变化的动态之中[5]。内质网膜中葡萄糖-6-磷酸酶是糖代谢的关键酶和内质网的主要标志性酶[6]。葡萄糖调节蛋白78（glucose regulated protein78， GRP78），即内质网分子伴侣重链结合蛋白，是热休克蛋白70家族的成员之一，葡萄糖调节蛋白94（glucose regulated protein94，GRP94）与热休克蛋白90的基因有50%同源且结构类似。GRP78和GRP94已成为内质网分子伴侣蛋白系统的重要组成部分，被视为内质网的两个标志性分子伴侣[7]。

1.2线粒体的结构与功能

线粒体是由双层单位膜套叠而成的封闭性膜囊结构，与细胞呼吸与能量转换密切相关，是细胞中含酶最多的细胞器。线粒体内膜上的非特异性通透性转运孔（the permeability transition pore， PTP）和外膜上的线粒体凋亡诱导通道（the mitochondrial apoptosis-induced channel，MAC）是线粒体膜上的两个重要通道[8]。线粒体对机体内环境变化非常敏感，特别是缺血性损伤时线粒体会因膜电位改变或结构变异而导致膜通透性的改变，最终引起多系统病理生理表现。因此线粒体结构功能失调、DNA受损及蛋白表达异常等已成为细胞分子病理学检查的重要依据，也常被视为细胞损伤最敏感的早期指标之一[9，10]。

1.3内质网和线粒体的结构功能耦联

内质网线粒体耦联结构由四种蛋白组成，分别是内质网侧的内质网锚定蛋白Mmm1和线粒体侧的线粒体相关蛋白Mdm10、Mdm12和Mdm34，他们与维持内质网线粒体的形态结构及功能密切相关[2]。内质网与线粒体在功能上相互影响、相互依存[11]。一方面，线粒体氧化磷酸化过程产生的ATP是内质网蛋白正确折叠的能量来源；另一方面，内质网蛋白折叠过程中产生的脂类物质又是线粒体膜赖以稳定的物质基础。线粒体内质网关联膜（mitochondria-associated ER membranes， MAMs）位于二者膜移行处，MAMs中富含鞘糖脂区域（glycosphingolipid-enriched microdomain，GEM）是控制内质网与线粒体间Ca2+流动的开关结构[12]，Ca2+是内质网与线粒体功能耦联的离子基础[5]。

2内质网应激和线粒体途径在脑缺血/再灌注损伤中的作用

2.1内质网应激在脑缺血/再灌注损伤中的作用

2.1.1 内质网应激机制 内质网功能发生紊乱时，会出现错误折叠或未折叠蛋白在内质网腔内聚集和Ca2+平衡紊乱，这种现象称为内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）。内质网应激发生时，机体为了对抗其引起的细胞损伤，多种应激反应将被直接或间接激活，主要的信号通路有：①未折叠蛋白反应（unfolded protein response， UPR）；②内质网超负荷反应（endoplasmic reticulum-overloaded response， EOR）；③胆固醇调节级联反应[13]，其中①和②系蛋白质加工紊乱所致；③系内质网表面合成的胆固醇减少所致，目前研究较为清楚的是UPR。通过上调或下调细胞的转录、翻译水平UPR产生以下效应：①通过激活PERK暂时性下调蛋白质合成速度，进而减轻内质网蛋白加工负担；②上调ERS相关蛋白的基因表达，进而促使错误折叠与未折叠蛋白恢复正常构象及维持内质网Ca2+平衡；③上调ERS降解途径的相关基因表达，进而清除无法恢复正确构象的糖蛋白，避免异常蛋白在内质网过度堆积。但长时间过强的ERS会诱导细胞凋亡，常见的凋亡途径有CHOP/GADD153激活通路、JNK激活通路和半胱氨酸蛋白酶caspase-12通路，其中caspase-12通路是内质网应激途径所特有的[14]，正常状态下caspase-12与GRP78结合，呈现无活性的前体蛋白。总之，内质网应激是一个存活与凋亡并存的过程，其中GRP78和GADD153分别是抗凋亡与促凋亡的两个平衡因素[15]。

2.1.2 脑缺血/再灌注损伤与内质网应激 目前对脑缺血/再灌注损伤的机制研究较多，内质网应激与脑缺血/再灌注损伤关系密切，非折叠蛋白反应是内质网应激的首要中心环节。脑缺血/再灌注时，通过氧化应激、钙超载等机制造成神经细胞损伤，进而引起内质网应激功能改变。病程初期，通过内质网应激反应可纠正错误折叠蛋白或未折叠蛋白重新恢复正确的空间结构，然而长时程过强的内质网应激反应则引起神经细胞的凋亡，所以内质网应激效应与脑缺血再灌注时间窗密切相关。有研究表明[16]，兔在大脑中动脉阻塞2h再灌注不同时间点的caspase-12、凋亡细胞数有着类似的变化规律，说明内质网应激反应与神经细胞凋亡之间有密切关系；也有研究表明[17]，脑缺血再灌注后的不同时间点GRP78和GADD153的表达不对称，缺血再灌注早期GRP78明显升高，后期反而下降，GADD153在缺血再灌注后期明显逐渐升高，说明内质网应激在早期发挥自稳功能以适应应激，后期以促使神经细胞凋亡为主。目前关于脑缺血的内质网应激途径报道甚多[18，19]，但都无明确的机制可循。

2.2线粒体途径在脑缺血/再灌注损伤中的作用

2.2.1 线粒体通路 Liu X等[20]早在1996年就已发现细胞色素C的释放与细胞凋亡有明显关系。在线粒体依赖性细胞凋亡途径中，线粒体膜渗透性转化孔开放、膜通透性升高和线粒体膜电位下降是线粒体形态功能改变的首要步骤，细胞色素C从线粒体内膜腔释放到胞浆是该凋亡过程的重要环节[21]，释放至胞浆的CytC可以与凋亡蛋白酶活化因子（Apaf-1）一起与caspase-9的前体结合，从而导致caspase-9的活化，后者可以激活caspase-3，最终引起细胞凋亡。膜上的BCL-2蛋白可阻止CytC释放，BAX蛋白则促使CytC释放。近年报道，3-磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）在多种疾病病理与细胞凋亡中都有过度表达[22]，能与线粒体膜上的电压门控离子通道相互作用，使线粒体内膜透化作用增强、电位丢失、基质肿胀及CytC和凋亡诱导因子释放增加。另有报道，GAPDH与非Caspase依赖性细胞死亡关系密切[23]。

2.2.2 脑缺血/再灌注损伤与线粒体通路 中枢神经系统对缺血缺氧非常敏感，常引起中枢神经系统功能障碍，甚至细胞死亡，线粒体功能障碍在缺血缺氧性脑损伤发生过程中起关键作用，线粒体膜上的MPTP是该过程的中心环节[24]。另外，脑缺血/再灌注损伤可引起神经细胞内外Ca2+紊乱，使细胞内Ca2+浓度增加，同时刺激线粒体摄入更多Ca2+，导致线粒体内出现Ca2+超载。Ca2+超载促进线粒体膜上的渗透性转化孔开放，导致线粒体肿胀破裂，释放细胞色素C、凋亡蛋白酶活化因子-1、凋亡诱导因子等与细胞凋亡密切相关的因子。脑缺血/再灌注损伤也可引起线粒体膜上的多种离子通道，特别是线粒体ATP敏感性K+通道，其功能状态直接影响线粒体乃至细胞的功能。在脑缺血缺氧时，SOD表达下调，ROS清除能力下降，ROS生成增多，抑制细胞色素C氧化酶mRNA转录，使电子传递链必需蛋白的合成减少，破坏电子传递，最终损伤脑组织。另外，线粒体也可通过坏死机制进而引起神经细胞死亡。

2.3内质网应激和线粒体通路在脑缺血/再灌注损伤中的联系

在各种损伤因素作用下，细胞会通过不同的途径和机制走向死亡，其中由内质网应激和线粒体所诱导的细胞凋亡途径起重要作用。内质网应激途径与线粒体途径之间的相互作用大体分为三种途径：内质网应激激发线粒体途径、线粒体功能失调诱导内质网应激反应途径与内质网应激和线粒体交互作用途径。本世纪初，Ito Y等[25]通过免疫电子显微镜观测并确认内质网上存在络氨酸蛋白激酶c-Abl，又由共聚焦显微镜证明c-Abl与内质网应激相关伴侣蛋白GRP78有共同的同源区域。内质网应激时，c-Abl转运到线粒体，加速CytC的释放而最终激发细胞凋亡。在c-Abl表达有缺陷的细胞中，内质网应激反应所致细胞凋亡明显减少。野田病毒感染实验中[26]，通过内质网应激反应上调的GRP78可与RNA依赖性RNA聚合酶相互作用而诱发线粒体依赖性细胞凋亡的发生。另外，借助于内质网与线粒体间的网状关联膜结构进行的内质网线粒体钙循环是内质网应激反应联合线粒体途径诱导细胞凋亡过程的中心环节[27]。Costa RO等[28]在阿尔茨海默病患者的血小板中，通过细胞质杂交技术发现，细胞色素C氧化酶的活化导致了线粒体的功能障碍，后者又上调了由Aβ诱导的内质网应激反应蛋白GRP78，进而加快了神经细胞凋亡的速度。Ip SW等[29]从姜黄属植物中提取的姜黄素可使内质网应激和线粒体的协同促凋亡作用加强，进而促使舌鳞状细胞癌中SCC-4细胞的凋亡。

3 展望

缺血性脑卒中是神经系统的常见病和多发病，如何减轻脑缺血/再灌注损伤是影响神经功能转归的主要因素之一。缺血/再灌注损伤中神经细胞凋亡机制逐渐受到广泛关注，其中内质网应激和线粒体通路业已成为研究的热点。但是，内质网应激联合线粒体途径在细胞死亡中协同作用的研究尚处于初级阶段，相关文献报道甚少。针对内质网应激联合线粒体的协同作用机制，综合干预并抑制其协同效应，更大程度地延缓或减少神经细胞凋亡，为临床上有效减轻缺血再灌注损伤治疗提供新的思路。

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（收稿日期：2013-05-15）