应用Fluoro-Jade C评价小鼠匹罗卡品模型中纹状体神经变性

[摘要] 目的：应用Fluoro-Jade C（FJC）染色方法在小鼠匹罗卡品癫痫模型中探测纹状体结构中神经元的变性情况，以了解纹状体结构在慢性颞叶癫痫发生中的病理神经基础。方法：雄性昆明小鼠10只（对照组5只，模型组5只）。在癫痫持续状态后3 d处死模型组小鼠。在纹状体水平切制冠状切片，行FJC染色，在荧光显微镜下观察FJC阳性细胞的形态和在纹状体（尾状壳核）中的整体分布情况。结果：在模型组，FJC染色的脑切片上清楚显示FJC阳性变性细胞呈亮黄绿色，呈神经元形态，胞体和突起均清晰显示。在纹状体（尾状壳核）内背侧1/3和尾侧部分出现许多FJC阳性细胞。结论：本研究运用FJC染色技术在小鼠匹罗卡品癫痫模型中显示纹状体中发生了神经元变性，提示纹状体可能在慢性颞叶癫痫的发生机制中起重要作用。

[关键词] Fluoro-Jade C；癫痫；匹罗卡品；神经变性

[中图分类号] R742.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2011）11（c）-021-03

Fluoro-Jade C staining in the assessment of neurodegeneration in the striatum of Pilocarpine-treated mice

WANG Lian, WEI Ling, FU Li

Local Cadres Ward, Kunming General Hospital of Chengdu Military Region, Yunnan Province, Kunming 650032, China

[Abstract] Objective: To detect degenerative neurons by Fluoro-Jade C (FJC) that may occurred in the striatum of pilocarpine-treated mice and to understand the pathologically neural basis of striatum in chronic epilepsy. Methods: Malemice (Kunming stain, n=10) were divided into Pilocarpine-treated group (n=5) and control group (n=5). Pilocarpine-treated mice were sacrificed at 3 d after status epilepticus. Brain coronal sections in the striatum levels were subject to FJC staining. Finally, FJC-stained brain and overall distribution of the Fluoro-Jade C positive cells sections were examined under an epifluorescence microscope to identify the shape in the striatum (caudate putamen). Results: The FJC-positive staining cells showed a bright green color in the somas and fine processes with neuronal profiles. Numerous degenerating cells could be seen in the medial dorsal one-third and caudal part of the striatum (caudate putamen). Conclusion: Massive neurodegeneration are demonstrated by FJC staining in the striatum of Pilocarpine-treated mice, suggesting that the striatum may play a role in recurrent seizure mechanism of chronic epilepsy.

[Key words] Fluoro-Jade C; Epilepsy; Pilocarpine; Neurodegeneration

颞叶癫痫是人类癫痫的常见形式，治疗难度大，发病机制复杂，目前仍有许多问题有待解决。中枢神经系统中许多关键性区域涉及颞叶癫痫的发作，如基底节在癫痫活动的启动和传播方面起重要作用[1]。在本研究中笔者应用新近发展的一类阴离子荧光配体组化染料Fluoro-Jade C（FJC，特异性标记中枢神经系统中正在变性的神经元[2-4]）和小鼠匹罗卡品颞叶癫痫模型研究了纹状体神经元的变性情况，深入了解慢性颞叶癫痫中癫痫反复发作的神经基础。

1 材料与方法

1.1 材料

实验动物为雄性昆明小鼠10只，鼠龄4～5周，体重20～25 g。试剂盐酸匹罗卡品（P6503）购自Sigma公司，使用前溶于生理盐水配制成质量浓度为10 mg/ml的溶液；硫酸阿托品注射剂（规格1 ml：0.5 mg；批号：091203）购自太极集团西南药业股份有限公司，配置成质量浓度为0.25 mg/ml的溶液；苯巴比妥钠注射液（规格1 ml：0.1 g；批号：100701）购自上海新亚药业有限公司；FJC（AG325）购自美国Chemicon公司。染液配制：用5%的NaOH溶液20 ml和100%乙醇80 ml配制成1%NaOH-80%乙醇混合液；用0.03 g高锰酸钾和50 ml蒸馏水配制成0.06%高锰酸钾溶液；10 ml蒸馏水和0.01 g FJC粉剂配制成质量浓度为0.1%的FJC储存液；用10 ml蒸馏水、10 μl 0.1% FJC储存液和10 μl醋酸液稀释成0.000 1% FJC工作液。

1.2 实验方法

将10只小鼠随机分为两组，每组5只，其中一组采用阿托品和生理盐水腹腔注射（对照组），另一组给予阿托品和匹罗卡品腹腔注射（模型组）。模型组小鼠在注射匹罗卡品前15 min，先腹腔注射阿托品（1 mg/kg），后腹腔注射匹罗卡品（首次量220 mg/kg），若未出现癫痫持续状态（status epilepticus，SE），则每隔30 min追加注射（每次1/3首次量），最终制成SE模型小鼠。癫痫发作严重性参照Racine分级：凝视不动为Ⅰ级，姿势僵硬为Ⅱ级，头部颤动及重复动作为Ⅲ级，后腿站立及肌阵挛为Ⅳ级，严重强直阵挛发作为Ⅴ级。在本实验中用于组织切片制备的是表现Ⅲ~Ⅳ级发作的小鼠。SE后60 min，腹腔注射苯巴比妥（45 mg/kg）终止SE；SE后2 h，腹腔注射生理盐水（0.8～1.0 ml/只）。在对照组，用等体积的生理盐水代替匹罗卡品，其他同模型组。生理盐水处理的小鼠无癫痫活动出现。

1.3 组织制备

小鼠通过经心灌注固定处死，模型组小鼠在SE后3 d时处死，对照组小鼠也在3 d时处死。腹腔注射戊巴比妥钠（40 mg/kg）深度麻醉小鼠，开胸，经左心室至升主动脉插管，生理盐水（15 ml）灌注，然后用40 ml质量浓度4%多聚甲醛溶液先快后慢灌注固定。取鼠脑在4℃条件下置多聚甲醛溶液中后固定，最后将鼠脑置于质量浓度20%蔗糖溶液在4℃条件下沉底。用O.C.T.复合物包埋脑组织、冰冻，在纹状体水平用恒冷箱冰冻切片机切制厚14 μm的冠状切片，贴于涂有明胶的载玻片上，晾干后进行FJC染色。

1.4 FJC染色

切片按先后顺序置于1%NaOH-80%乙醇混合液5 min，70%乙醇2 min，蒸馏水2 min，0.06%高锰酸钾溶液10 min，蒸馏水2 min。取出切片后将0.000 1% FJC染液滴于切片上反应10 min（避免强光照射），再将切片用蒸馏水漂洗3次（1 min/次），晾干，二甲苯透明1 min。用中性树胶封片后在Olympus BX60荧光显微镜下采用蓝色滤色片观察并采集图像。组织结构和命名参照Paxinos和Franklin的小鼠图谱[5]。

2 结果

2.1 FJC阳性变性神经元的形态

在模型组，FJC染色的脑切片上染色背景很浅，FJC阳性变性细胞呈亮黄绿色，呈神经元形态，胞体和突起均清晰显示（图1）。在对照组未见FJC阳性细胞。

2.2 脑结构变化和FJC阳性变性神经元在纹状体的分布

在模型组，发生SE的小鼠侧脑室和第三脑室扩大。纹状体（尾状壳核）内背侧1/3和尾侧部分见到许多FJC阳性细胞（图2）。

3 讨论

确定皮质和皮质下区特定区域在癫痫发作中的作用能更好地了解癫痫的发生机制和行为损害，也有利于为癫痫的预防和治疗提供靶点[6]。许多关键脑区参与癫痫活动的产生和传播[7]。在本研究中，笔者应用一种阴离子荧光配体即FJC在昆明小鼠匹罗卡品颞叶癫痫模型中探测变性细胞，结果显示在纹状体（尾状壳核）内背侧1/3和尾侧部分发现许多FJC阳性细胞，提示了SE后在这些区域发生了神经元变性。

越来越多的证据显示，皮质下结构在癫痫发作的行为学表现、癫痫活动的扩布甚至启动方面起作用[8]。基底节是感觉运动皮质和边缘系统之间的交通中心，参与运动性癫痫到执行靶点的传播及边缘结构中癫痫活动的产生[9]。纹状体是基底节的接受部分，接受来自大脑皮质的输入。皮质纹状体兴奋性谷氨酸传导调节纹状体内的多个位点[4]。腹侧杏仁核传出通路直接从杏仁体投射到腹侧纹状体，其中一些密集地投射到壳核和苍白球[8]。

自19世纪开始，基底节在前脑癫痫传播中的作用引起了相关专家的兴趣。Turski等[9]应用系统注射匹罗卡品诱发边缘性癫痫来研究基底节内调节癫痫发作阈值的神经元途径，在尾状核和壳核中双侧微注射兴奋性氨基酸衍生物N-甲基-D-天（门）冬氨酸（当注射入大脑皮质、杏仁核或海马时为强有力的致惊厥剂）时可拮抗匹罗卡品诱导的边缘性癫痫。这种抗惊厥作用在整个尾状核-壳核均可观察到，但是尾状核-壳核的腹后部分作用最显著。通过双侧微注射神经兴奋毒素鹅膏蕈氨酸来损害尾状核-壳核则使匹罗卡品的致癫用量减少。通过阻断黑质网状部或脚内核内的γ-氨基丁酸（GABA）介导的抑制可使尾状核-壳核的抗惊厥作用逆转。结果提示尾状核-壳核及其GABA依赖的传出途径调节边缘结构的癫痫发作阈值。

临床影像学研究也显示，在颞叶癫痫患者发作期间常观察到尾状核、壳核和丘脑出现发作期高灌注。此观察和术后同侧尾状核代谢减低的研究提示在颞叶和纹状体之间有共同的功能联系[10]。基底节和额颞叶之间有许多联系，因此基底节的高灌注可能是经皮质纹状体连接由皮质灶继发皮质下激活所致[11]。用发作期单光子发射计算机断层减影和磁共振成像配准[subtraction ictal single-photon-emission computed tomography（SPECT）coregistered to magnetic resonance imaging（MRI），SISCOM]复合技术对颞叶内侧癫痫患者的研究资料最常显示在前颞区出现发作时高灌注，并常同时累及基底节和岛叶，这可能代表了癫痫传播的主要区域，可能是由于致癫灶触发的神经元过度活动扩展所致[11-12]。另外，因为纹状体和丘脑通过穹隆和体接受来自海马和杏仁核的大量纤维支配，所以海马的细胞丧失导致了到同侧纹状体和丘脑的输出减少，因此在颞叶癫痫患者出现皮质下结构低代谢。对顽固性颞叶内侧癫痫患者进行基于像素的形态定量研究显示中脑、皮质下核（如丘脑和尾状核）及顶枕区显示灰质密度降低[10]。这提示在功能和解剖上与海马联系的脑区出现容积缩小。Geary等[8]的研究也显示了相似的结果。

总之，本研究不仅证实FJC在检测神经元变性方面敏感、可靠、简单，而且提示纹状体可能在慢性颞叶癫痫的发生机制中起重要作用，从治疗干预的可能性角度考虑，这有助于探测神经保护措施以预防或减轻癫痫发作。

[参考文献]

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[9] Turski L, Meldrum BS, Cavalheiro EA, et al. Paradoxical anticonvulsant activity of the excitatory amino acid N-methyl-D-aspartate in the rat caudate-putamen [J]. Proc Natl Acad Sci USA,1987,84(6):1689-1693.

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（收稿日期：2011-07-26）

[作者简介] 王莲，女，博士，主治医师；研究方向：癫痫。