标本处理方法对尿液蛋白电泳的影响

[摘要] 目的 探讨不同蛋白沉淀方法对尿液标本蛋白电泳效果的影响。方法 采集尿液标本8份，分别采用丙酮沉淀法、TCA/丙酮沉淀法及ACN/TFA沉淀法对尿液标本进行蛋白沉淀，然后进行双向电泳，比较3种标本处理方法后蛋白电泳蛋白点数及图像清晰程度。结果TCA/丙酮沉淀后电泳图谱清晰，丙酮沉淀法及ACN/TFA沉淀后单边电泳图谱具有较多横纹干扰条带，尿液标本TCA/丙酮沉淀后电泳蛋白点数高于丙酮沉淀法及ACN/TFA沉淀法，差异具有统计学意义。结论 在丙酮沉淀前应用TCA可以消除干扰等电聚焦的盐类物质，进一步降低标本的导电能力，并且能够最大程度地提取尿液中的蛋白质。

[关键词] TCA/丙酮沉淀；丙酮沉淀；ACN/TFA沉淀；尿液标本；蛋白

[中图分类号] R446.1 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2011）24-131-02

Effect of Different Handling to Protein Electrophoresis on Urine Specimen

WANG Yunjie

Department of Clinical Laboratory，Aiyimei Hospital of Fenghua City in Zhejiang Provience，Fenghua 315000，China

[Abstract] Objective To investigate the effect of different handling to protein electrophoresis on urine specimen. Methods Eight urine specimen were selected and urine protein were sedimented with acetone precipitation method，Trichloroacetic acid（TCA）/ acetone precipitation method and Acetonitrile（ACN）/Trifluoroacetic acid（TFA）precipitation method，and urine specimen had a biphase electrophoresis，proteinic counting and proteinic of electrophoretogram were contrasted. Results Electrophoretogram was limpid in urine protein sedimented with TCA/acetone precipitation method，there was some transverse striation and interference strap in acetone precipitation method and ACN/TFA precipitation method，proteinic counting of electrophoretogram was higher in TCA/ acetone precipitation method than in acetone precipitation method and ACN/TFA precipitation. Conclusion TCA handling before acetone precipitation chould eliminated effected of electrofocusing salts on urine specimen，and extracted urine protein in max degree.

[Key words] TCA/ acetone precipitation；Acetone precipitation；ACN/TFA precipitation；Urine specimen；Protein

尿液是临床常见的检验标本，尿液标本容易获取，其中蛋白质含量检测是最常用的检测项目，尿液中蛋白质的含量检测能够反应肾脏及泌尿系的病变。如肾小球基底膜的滤过功能、某些泌尿系的肿瘤，甚至能够为某些泌尿系以外疾病提供诊断依据，尿液标本中含有较多蛋白外杂质成分，在检测过程中能够影响蛋白的检测效果，为此我们采用不同的方法对尿液标本中蛋白进行沉淀处理，分析其对尿液标本蛋白电泳检测的影响。

1 材料与方法

1.1 标本来源

尿液标本来自2009年12月～2010年1月本院体检中心患者常规送检尿液，均为中段尿液。所有尿液标本均在采集2h内送检。尿液标本送检后低温离心后上清液深低温冰箱保存待检。

1.2 主要仪器及试剂

Tris-HCL缓冲液、四甲基乙二胺（南京建成生物工程研究所），3-[3-胆酰胺丙基]-乙二胺-1-丙磺酸、甘氨酸、二烷基硫酸钠（SDS）（碧云天生物试剂有限公司），丙酮、三氯乙酸（Trichloroacetic acid，TCA），二硫苏糖醇（DTT）、乙腈（Acetonitrile，ACN），碘乙酰胺和三氟乙酸（Trifluoroacetic acid，TFA）（武汉博士德生物试剂公司），Sypro Ruby 蛋白胶染色液（美国Invitrogen公司）IEF缓冲液、固相pH梯度干胶条（美国Bio-Rad公司），IPGphor电泳仪，Imager Scanner扫描仪（购自安发玛西亚生物技术有限公司）；ProteinⅡ垂直电泳单元（美国Bio-Rad公司），蛋白分析采用APPle软件系统。

1.3 尿液标本沉淀

尿液标本解融后分为3份，每份5mL，分别采用丙酮沉淀法、ACN/0.1%TFA沉淀法及TCA/丙酮沉淀法沉淀，丙酮沉淀法尿液标本加入2.5mL 4℃丙酮，ACN/0.1%TFA沉淀法中沉淀试剂选择ACN/0.1%TFA溶液，过夜沉淀后采用低温离心机10 000r/min离心10min，弃去上清，沉淀低温干燥后备用。TCA/丙酮沉淀法中5mL尿液加入90%TCA溶液40mL，-20℃过夜沉淀，4℃条件下25 000r/min离心；沉淀超声粉碎后重悬与丙酮溶液，4℃25 000r/min离心15min；沉淀真空干燥，LIEF缓冲液重悬，用于双向电泳。

1.4 双向电泳

1.4.1 固相pH梯度干胶条等电聚焦 尿液沉淀标本IEF缓冲液重悬，固相pH梯度干胶条覆盖样品，并用干胶条覆盖油覆盖胶条以防止等电聚焦时尿素析出、蛋白质氧化。过夜水化后进行等电聚焦。等电聚焦条件：100V、300V及600V电压除盐2h 共3次，1000～3000V梯度升压，500V等电聚焦。等电聚焦后的胶条在-80℃条件下静止1h，平衡液中平衡15min。

1.4.2 第二向垂直平板电泳和染色 平衡后的胶条置于8%～16% SDS-PAGE胶上端，用0.5%的琼脂糖封胶。200V电泳1h。电泳结束后，取出胶，分别用Sypro Ruby和Coomassie Blue 溶液染色，Pharos imager扫描仪进行扫描。

1.4.3 图象分析 图像分析采用Quantity one蛋白分析软件，分析过程包括通过自动检测和手工标记进行蛋白质斑点检测。

1.5 统计学处理

数据处理采用SPSS11.5统计软件进行，检测蛋白图谱质量分析采用描述法，点数比较组间相关性采用方差分析，组间比较采用t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 电泳条带蛋白电泳图谱质量分析

三种蛋白沉淀方法处理的尿液标本蛋白电泳图谱比较发现，TCA/丙酮沉淀法提取尿液蛋白质样品的蛋白及背景清晰，丙酮沉淀法和ACN/0.1%TFA沉淀法处理的尿液标本电泳图谱蛋白及背景清晰度较差，有较多干扰条纹。见图1。

图1 丙酮沉淀法（a）和ACN/0.1%TFA沉淀法（b）所得到的尿液2-DE胶，（c）尿液在20%TCA中-20℃沉淀2h，经丙酮沉淀，离心干燥后所得到的液体置于-20℃24h后进行2-DE

2.2 三种蛋白沉淀方法电泳图谱点数分析

丙酮沉淀法蛋白电泳图谱蛋白点数是（24.0±7.2），ACN/TFA沉淀法蛋白电泳图谱蛋白点数是（36.0±11.4），TCA/丙酮沉淀法蛋白电泳图谱蛋白点数是（79.0±15.9），ACN/TFA沉淀法及TCA/丙酮沉淀法蛋白电泳图谱蛋白点数高于丙酮沉淀法，TCA/丙酮沉淀法蛋白电泳图谱蛋白点数高于ACN/TFA沉淀法。见表1。

3 讨论

尿液是临床常用的检测标本，其中尿蛋白的检测是主要的检测项目之一，尿液中微量蛋白的定性及定量检测能够为肾小球的滤过功能评价及为某些疾病异常蛋白质的排泄提供参考依据[1]，尿液标本中蛋白含量较少，一般每天经泌尿系排泄的蛋白总量低于150mg，常规的检测方法很难取得较为精确的检测效果，泌尿系是体内物质排泄的主要途径之一，因此尿液的成分变化较大，在不同时间及不同个体的尿液标本中物质含量也存在较为明显的差异[2]。

肾脏是无机盐的主要排泄途径，因此尿液中无机盐的含量较为丰富，而且与个体的饮食及健康状况等密切相关，个体差异较为明显，因此为了减少无机盐等杂质的干扰，提高尿蛋白的检测效果，在临床检测过程中常需对尿液标本进行预处理[3]，进行蛋白浓缩、脱盐等处理，增加样品中的蛋白浓度，提高检测的效果。尿液蛋白的预处理方法较多[4]，如沉淀、固态提纯法、离心过滤、超速离心等方法，但是标本处理的过程可能伴随蛋白质的丢失，而且采用离心、固态提纯等方法对于管型杂质等去除能力较差，丙酮、ACN均为标本蛋白沉淀的常用试剂[5]，能够沉淀标本中的蛋白，但是也存在着在沉淀过程中蛋白丢失回收率较低，不能避免无机盐干扰等问题，因此采用试剂对尿液标本进行脱盐能够提高蛋白的检测效果，减少无机盐的干扰及无机盐电荷引起的蛋白异常聚集等[6]。

我们采用TCA对丙酮沉淀后尿液标本进行脱盐处理，TCA能消除干扰等电聚焦的盐和其他一些分子，降低导电能力。结果发现，丙酮沉淀后采用TCA处理的尿液标本蛋白电泳后的图谱更为清晰，蛋白点数明显提高，蛋白及无机盐杂质引起的横纹条带干扰减少，其蛋白点数高于单独应用丙酮沉淀及CAN/TFA连续沉淀。研究结果说明采用丙酮沉淀蛋白、TCA除盐的尿液标本预处理放大，能够提高尿液标本中蛋白的检测效果。

[参考文献]

[1]谢健敏，张成禄，于新发，等. 尿微量白蛋白及尿蛋白定量测定在慢性肾脏病患者肾功能评估中的价值[J]. 实验与检验医学，2011，29（1）：41-42.

[2] Zhou H，Yuen PS，Pisitkun T，et al. Collection，storage，preservation，and normalization of human urinary exosomes for biomarker discovery[J]. Kidney Int，2006，69：1471-1476.

[3] 胡秋娈，冯爱青，赵淑珍，等. 磺氯酚N-Cu（Ⅱ）-HSA-OP体系对尿蛋白的测定[J]. 分析测试学报，2011，30（1）：68-71.

[4] 刘靖芳，施秉银. 不同蛋白沉淀方法对尿蛋白双向电泳结果的影响[J]. 山东医药，2010，50（14）：101-102.

[5] 崔永锋，杨贞，朱宝华，等. 三氯醋酸-丙酮沉淀法用于骨组织蛋白的提取[J]. 中国医学科学院学报，2011，33（2）：210-213.

[6] 董明国，杨明建. TCA/丙酮沉淀对尿液标本中微量蛋白效果分析[J]. 吉林医学，2010，31（36）：6691.

（收稿日期：2011-06-09）