恶性疟原虫顶端膜抗原1基因转染伯氏疟原虫模型的建立

作者：陈俊，缪军，刘忠湘，李淑梅，薛采芳

【关键词】 伯氏疟原虫；恶性疟原虫；顶端膜抗原1；转染

【Abstract】 AIM: To establish the model of Plasmodium berghei (P. berghei) transfected with Plasmodium falciparum (P. falciparum) apical membrane antigen1 (AMA1) gene. METHODS: The transfection plasmid pDB.DTm.DB./AB.AF.DB. containing P.falciparum AMA1 was enzymed by BglI. Blood stages of P.berghei were cultured in vitro, and mature schizonts were purified. Parasites transfected by electroporation were injected into tail veins of mice. Transfected parasites were selected by treating mice with pyrimethamine. DNA of transfected, resistant parasites was isolated and analyzed by PCR.RESULTS: The gene encoding P.falciparum AMA1 was amplified by PCR in the transfected parasites. CONCLUSION: The model of P.berghei transfected with P.falciparum AMA1 gene was established, which provided a basis for further study.

【Keywords】 Plasmodium berghei；Plasmodium falciparum；apical membrane antigen1；transfection

【摘要】 目的： 建立恶性疟原虫顶端膜抗原1（AMA1）基因转染伯氏疟原虫的模型. 方法： 将含有恶性疟原虫AMA1基因的重组转染质粒pDB.DTm.DB./AB.AF.DB.用BglI酶切线性化. 伯氏疟原虫经体外培养和分离后进行电转化，转化的原虫经药物筛选后进行PCR检测. 结果： PCR检测显示转染伯氏疟原虫存在恶性疟原虫AMA1基因. 结论： 成功建立了恶性疟原虫AMA1基因转染伯氏疟原虫的模型,为进一步研究提供了基础.

【关键词】 伯氏疟原虫；恶性疟原虫；顶端膜抗原1；转染

0引言

疟疾是世界上对人类危害最严重的传染病之一. 目前药物和疫苗对疟疾，尤其是恶性疟的防治效果均不理想. 对疟原虫生物学特性的深入研究可能为疟疾防治提供新的思路. 疟原虫转染技术的应用，为进一步研究疟原虫的生物学特性，特别是蛋白质结构与功能提供了有效的实验手段［1］. 顶端膜抗原1（AMA1）是疟疾红内期疫苗的重要候选抗原. 在鼠疟模型和猴疟模型中，鼠和猴疟原虫AMA1可诱导保护性免疫的产生［2-3］. 我们建立了恶性疟原虫AMA1基因转染伯氏疟原虫的模型,为更深入研究恶性疟原虫AMA1的功能及评价恶性疟原虫AMA1特异性抗体在体内的保护性作用提供了新的工具.

1材料和方法

1．1材料水平式离心机(北京医疗仪器厂产品,型号LXJ6401)，电穿孔仪Nucleofector Device（Amaxa）. 伯氏疟原虫ANKA株由我室保存. 清洁级Wistar大鼠（200 g）和昆明小鼠(18～20 g)由第四军医大学实验动物中心提供. 转染质粒pDB.DTm.DB./AB.AF.DB.［4］含有伯氏疟原虫的二氢叶酸还原酶/胸腺嘧啶合成酶突变体基因（DHFR/TS），提供乙胺嘧啶抗性,由德国海德堡大学Bujard教授惠赠. 核酸内切酶BglI（大连TaKaRa），凝胶回收试剂盒（上海华舜生物工程公司），胎牛血清(Gibco)，Nycodenz(AxisShield)，乙胺嘧啶(Sigma)，Human T Cell Nucleofector Kit(Amaxa).

1.2方法

1．2．1转染质粒的线性化重组转染质粒pDB.DTm.DB./AB.AF.DB.用BglI酶切后，胶回收线性化片段，将浓度稀释为1 g/L，-20℃保存备用.

1．2．2伯氏疟原虫的培养液氮中保种的伯氏疟原虫ANKA株经腹腔接种昆明小鼠，待原虫率达5％～15％，鼠尾静脉取血, 以40 μL/只腹腔接种Wistar大鼠. 4～5 d后，原虫率达1%～3％，且大部分原虫处于环状体和早期滋养体时，心脏穿刺取血. 鼠血用250 mL/L的胎牛血清洗涤1次，用水平式离心机以1500 r/min离心8 min. 洗涤后的细胞用250 mL/L的胎牛血清重悬后加入锥形瓶，并在瓶中注入含50 mL/L CO2, 50 mL/L O2和900 mL/L N2的混合气体，将瓶口封严后置于37℃以30 r/min低速振摇培养22 h.

1．2．3成熟裂殖体的分离在Nycodenz细胞分离液上小心加入体外培养的原虫，用水平式离心机以1500 r/min离心30 min. 含有成熟裂殖体的红细胞位于两层悬浮液之间，呈棕色. 小心吸取棕色层的细胞，用250 mL/L的胎牛血清洗涤1次，以1500 r/min离心8 min.

1．2．4电穿孔转化将原虫按1×107重悬于100 μL含10 μg转染质粒的“Human T cell Nucleofector Solution”缓冲液. 重悬后的液体加入电转杯，用电穿孔仪Nucleofector Device进行电穿孔转化，程序设定为U33. 电转化后迅速向电转杯加入50 μL细胞培养液进行重悬.

1．2．5转化原虫的筛选将上述150 μL重悬液经尾静脉注射昆明小鼠. 24 h后将乙胺嘧啶按10 mg/kg腹腔注射感染转化原虫的昆明小鼠，每日注射1次，连续注射5 d. 鼠尾静脉采血涂片观察原虫感染率.

1．2．6转化原虫的检测待原虫感染率＞1％，将被感染小鼠摘除眼球取血，收集红内期原虫，并抽取原虫的基因组DNA，以其为模板进行PCR检测，选用转染质粒pDB.DTm.DB./AB.AF.DB.及恶性疟原虫云南株基因组DNA作为阳性对照，未转染的伯氏疟原虫ANKA株为阴性对照. 参照GenBank中已发表的恶性疟原虫AMA1胞外域的基因序列设计引物. 上游引物：5′ATG ATT GAA ATA GTA GAA AGA AGT3′；下游引物：5′TTA TTT CAT GTT ATC ATA AGT TGG3′. 引物由上海生物工程技术服务有限公司合成. PCR反应条件为：94℃预变性2 min；94℃ 30 s，50℃ 30 s，68℃ 80 s，30个循环；68℃延伸5 min. PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳后进行分析.

2结果

连续5 d药物筛选后，鼠尾静脉采血涂片显示原虫感染率达3％. 转化原虫的基因组DNA和阳性对照组DNA经PCR扩增后均获得约1350 bp的条带，与恶性疟原虫AMA1胞外域基因片断长度相符，而未转染的伯氏疟原虫基因组DNA未扩增出条带（图1），证明目的基因已经整合入伯氏疟原虫的基因组.

3讨论

疟原虫转染技术是研究疟原虫蛋白质结构和功能的重要方法. 将外源DNA导入寄生于红细胞的疟原虫细胞核，必须经过红细胞膜、纳虫泡膜、疟原虫细胞膜和虫体细胞核膜4层膜，实际进入虫体核内的DNA可能很少. 所以，转染效率对于疟原虫转染的成败十分关键. 对人原代细胞和干细胞等进行转染的研究表明，Amaxa的电穿孔仪Nucleofector Device具有较高的转染效率［5-7］. 我们利用Nucleofector Device成功建立了伯氏疟原虫的转染技术，为研究疟原虫的生物学特性奠定了技术基础.

1：质粒pDB.DTm.DB./AB.AF.DB.；2：恶性疟原虫基因组DNA；3：转染伯氏疟原虫基因组DNA；4：未转染伯氏疟原虫基因组DNA;M：DNA分子质量标准.

图1转化原虫的PCR检测

AMA1是疟疾红内期疫苗的重要的保护性抗原，用其纯化的天然抗原或重组蛋白在小鼠和猴体模型中均诱导出对疟原虫攻击的保护性免疫，自流行区人群分离的AMA1特异性抗体在体外可抑制恶性疟原虫裂殖子入侵红细胞［8］. 由于恶性疟原虫专性寄生于人体，故实验室研究中缺乏恶性疟原虫的感染动物模型，这给评价保护性抗体在体内抑制恶性疟原虫的作用造成了极大障碍. 我们建立的恶性疟原虫AMA1基因转染伯氏疟原虫模型，为评价恶性疟原虫AMA1特异性抗体的保护性作用提供了条件.

【参考文献】

［1］ Waters AP, Thomas AW, van Dijk MR, et al. Transfection of malaria parasites［J］. Methods，1997，13(2):134-147.

［2］ Xu H, Hodder AN, Yan H, et al. CD4+ T cells acting independently of antibody contribute to protective immunity to Plasmodium chabaudi infection after apical membrane antigen 1 immunization［J］. J Immunol，2000，165(1):389-396.

［3］ Kocken CH，Dubbeld MA，van der Wel A, et al. Highlevel expression of Plasmodium vivax apical membrane antigen 1 (AMA1) in Pichia pastoris: strong immunogenicity in Macaca mulatta immunized with P. vivax AMA1 and adjuvant SBAS2［J］. Infect Immun，1999，67(1):43-49.

［4］ Kocken CH, van der Wel AM, Dubbeld MA, et al. Precise timing of expression of a Plasmodium falciparumderived transgene in Plasmodium berghei is a critical determinant of subsequent subcellular localization［J］. J Biol Chem，1998，273(24):15119-15124.

［5］ Hamm A, Krott N, Breibach I, et al. Efficient transfection method for primary cells［J］. Tissue Eng，2002，8(2):235-245.

［6］ Maasho K, Marusina A, Reynolds NM, et al. Efficient gene transfer into the human natural killer cell line, NKL, using the Amaxa nucleofection system［J］. J Immunol Methods，2004，284(12):133-140.

［7］ HaleemSmith H, Derfoul A, Okafor C, et al. Optimization of highefficiency transfection ofhuman mesenchymal stem cells in vitro［J］. Mol Biotechnol，2005，30(1):9-20.

［8］ Hodder AN, Crewther PE, Anders RF. Specificity of the protective antibody response to apical membrane antigen 1［J］. Infect Immun， 2001， 69(5):3286-3294.