IFITM1对结肠癌SW480细胞增殖和黏附的影响

作者：何敬东，张振书，肖冰，周高速，张以洋，耿焱，张亚历，智发朝，赖祝胜，李旭 【关键词】 基因转染

Effects of IFITM1 genes on proliferation and adhesion of colorectal carcinoma cell line SW480

【Abstract】 AIM: To investigate the effects of interferon induced transmembrane protein 1 (IFITM1) on the proliferation and heterotypic adhesion of SW480 cell line. METHODS: Recombinant vectors of pEGFPC3/IFITM1were constructed and were then transfected to the SW480 cell line. After being selected by G418, the subclone cell line was obtained. Laser confocal microscopy (LCSM ) was used to examine green fluorescence protein (GFPIFITM1) for the gene expression position in cell line. The proliferation of cell line was detected by the cell growth curve and adhesion of cell line was evaluated by cell adhesion assay. RESULTS: The sequence of recombinant vectors of pEGFPC3/IFITM1 was consistent with the IFITM1 sequence. After SW480 cells being transfected by eukaryotic expression vector of pEGFPC3/IFITM1, the subclone cell line IFITM1/SW480 was obtained by persistent G418 selection. The findings of LCSM showed that GFPIFITM1 protein was located in IFITM1 cell membranes, suggesting correct expression of IFITM1 genes after transfection. The cell growth curve showed that the proliferation of IFITM1/SW480 was reduced. The adhesive cell numbers of IFITM1/SW480 were（3.93±0.08）×103 and (6.10±0.21)×103 at 30 min and 60 min, respectively, dramatically lower than those in the control groups of pEGFPC3/SW480 ［(4.61±0.25) ×103, (7.17±0.22) ×103 at 30 min and 60 min, respectively (P<0.05)］. CONCLUSION: The IFITM1 can inhibit the proliferation and heterotypic adhesion of SW480 cell line in vitro.

【Keywords】 membrane proteins; cell proliferation; cell adhesion; gene transfect

【摘要】 目的：研究干扰素诱导的跨膜蛋白1(IFITM1)对结肠癌细胞SW480增殖和异质黏附的影响. 方法：构建pEGFPC3/IFITM1 重组质粒，重组质粒转染结肠癌细胞株SW480，G418筛选获得亚克隆细胞株，用激光共聚焦扫描检查绿色荧光蛋白. 生长曲线法检测细胞的增殖，细胞黏附实验检测细胞的黏附性. 结果： pEGFPC3/ IFITM1重组质粒的测序序列与IFITM序列完全一致，重组质粒转染SW480细胞后,通过G418持续压力筛选获得亚克隆细胞株IFITM1/SW480. 激光共聚焦显微镜检查结果显示表达的绿色荧光蛋白位于IFITM1/SW480的细胞膜上，提示转染后IFITM1正确表达. 细胞生长曲线显示转染后的IFITM1/SW480细胞增殖活性比对照组增殖活性明显降低. IFITM1/SW480细胞黏附数30，60 min分别为（3.93±0.08）×103和(6.10±0.21)×103，而对照组 pEGFPC3/SW480细胞黏附数30，60 min分别为(4.61±0.25)×103, (7.17±0.22)×103，IFITM1/SW480细胞黏附数比对照组细胞黏附数显著降低（P＜0.05）. 结论：IFITM1可抑制SW480细胞体外增殖和异质型黏附.

【关键词】 膜白质类；细胞增殖；细胞黏附；基因转染

0引言

干扰素诱导的跨膜蛋白1（interferon induced transmembrane protein 1，IFITM1 ）是调节IFN抗增殖、分化的重要蛋白，与细胞的黏附性、增殖及对IFN治疗的敏感性有关. IFN可诱导IFITM1在U937, Jurkat, K562等细胞中表达. 我们在筛选大肠癌cDNA噬菌体表达文库时获得IFITM1基因，为了研究该基因在结肠癌中的作用，我们构建了pEGFPC3/IFITM1真核重组质粒并且转染到大肠癌细胞株SW480中，旨在探讨IFITM1对SW480增殖及细胞黏附的影响.

1材料和方法

1.1材料

人源性大肠癌细胞株SW480由本实验室常规传代培养，DH5α感受态细菌为本实验室保存. T4连接酶购自NEB公司，Pfu DNA聚合酶， 限制性内切酶Hind III和Bam HI，PCR产物纯化试剂盒购自TaKaRa公司； Lipofectamine 2000TM购自Invitrogen公司；optiMEN I，G418购自Gibco公司；RPMI 1640细胞培养液、类标准胎牛血清购自兰州民海公司；IV型胶原购自Sigma公司；pEGFPC3载体由瑞典卡罗琳斯卡大学张宏权教授惠赠.

1.2方法

大肠癌细胞株SW480置于37℃，饱和湿度，50 mL/L CO2的孵箱中培养，100 mL/L的类标准胎牛血清和100 ku/L青霉素及链霉素的RPMI 1640培养. 构建IFITM1重组质粒：上游引物：5′GCAAGCTTATGCACAAGGAGGAACATGAG3′； 下游引物：5′AGAGGATCCCTAGTAACCCCGTTTTTCCTG3′，用Pfu DNA聚合酶扩增IFITM1，扩增条件为 95℃ 3 min,95℃ 30 s,58℃ 30 s,72℃ 1 min ，33循环，72℃延伸5 min. 预计扩增产物长度为395 bp. PCR产物纯化后经Hind III和Bam HI酶切后亚克隆到pEGFPC3表达载体上. Hind III和Bam HI限制性内切酶酶切鉴定重组质粒，阳性重组质粒送上海博亚生物公司测序. 对数生长期的SW480细胞，2.5 g/L胰酶消化后离心，用培养基将细胞数调到1×108个/L ，每个6孔板2 mL，培养12 h后. 用optiMEN I稀释Lipofectamine 2000TM和IFITM1/pEGFPC3重组质粒，按照Lipofectamine 2000TM脂质体转染试剂操作说明手册操作. G418 400 mg/L筛选获得亚克隆细胞株IFITM1/SW480. 激光共聚焦显微镜扫描观察绿色荧光融合蛋白在细胞中的位置，报告目的基因IFITM1在细胞中的正确表达. 实验同时设置转染pEGFPC3的SW480细胞（pEGFPC3/SW480）作为对照. 将pEGFPC3/SW480，SW480细胞及IFITM1/SW480细胞按104/孔接种于24孔板，用100 mL/L类标准胎牛血清的RPMI 1640培养液培养，每日取3孔，用2.5 g/L胰酶消化法进行活细胞计数，每孔计数3次，计算均值；以培养时间为横轴，细胞数为纵轴，绘制细胞生长曲线. IFITM1/SW480及对照组pEGFPC3/SW480和SW480的对数生长期细胞用2.5 g/L胰酶消化，并用无血清的RPMI 1640培养液（含5 g/L BSA）稀释至1×108/L，加入已经用15 mg/L IV型胶原、150 μL/孔包被的96孔板内，每孔100 μL，置于37℃，50 mL/L CO2的孵箱中培养30，60 min. 用PBS液轻轻洗3遍，洗去未黏附的细胞. 再用2.5 g/L胰酶消化，收集细胞并计数.

统计学处理: 采用SPSS 13.0软件对实验数据进行方差分析,数据以x±s表示.

2结果

pEGFPC3/IFITM1重组质粒经Hind III和Bam HI限制性内切酶酶切，获得DNA插入片段与目的基因大小一致，表明目的基因已经插入到pEGFPC3的Hind III和Bam HI多克隆位点之间（Fig 1），插入 的DNA序列与IFITM1全长cDNA序列一致. G418筛选获得亚克隆细胞IFITM1/SW480，激光共聚胶显微镜扫描显示绿色荧光融合蛋白（GFPIFITM1）呈现在细胞膜上，提示基因的正确表达. 而转染空载体pEGFPC3的SW480细胞绿色荧光多在细胞质内（Fig 2,3）. 转染IFITM1基因的SW480细胞生长曲线如Fig 4所示， IFITM1/SW480细胞的生长曲线比pEGFPC3/SW480及SW480细胞对照组降低. 表明IFITM1可抑制SW480细胞的增殖.

IFITM1/SW480细胞黏附数30，60 min分别为（3.93±0.08）×103和(6.10±0.21)×103，而对照组 pEGFPC3/SW480细胞黏附数30，60 min分别为(4.61±0.25)×103, (7.17±0.22)×103，IFITM1/SW480细胞黏附数比对照组细胞黏附数显著降低（P＜0.05, Tab 1）.表1IFITM1对SW480细胞黏附的影响（略）

3讨论

IFITM1在多种细胞如U937， Jurkat， K562，RSa表达，该基因的表达与细胞增殖、黏附及细胞对IFN的敏感性有关［1］. 采用转基因技术是研究基因功能常见的方法［2］. 我们构建pEGFPC3/IFITM1重组质粒并转染SW480细胞，使SW480细胞高表达IFITM1. 通过激光共聚焦显微镜检查绿色荧光融合蛋白，可以明确目的基因的表达及其在细胞中位置，可以预测基因表达的正确性［3］.

IFITM1/SW480细胞的生长曲线低于SW480和pEGFPC3/SW480细胞，说明IFITM1具有抑制大肠癌细胞株SW480增殖的作用. 其抑制细胞生长的机制可能与该基因编码的跨膜蛋白与其他蛋白相连接形成多功能的复合物，该复合物抑制细胞生长信号传导作用有关；还可以调节干扰素的信号通路，抑制细胞增殖. 另外，IFITM1是几种细胞膜蛋白的一个组成部分，这几个膜蛋白包括CD19，CD21，CD81，而CD81是一个26 ku的抗增殖蛋白（TAPA，target of antiproliferation Ab1），该蛋白的靶蛋白可能是IFITM1而调节细胞生长和细胞黏附［4］. 以往的研究表明IFITM1触发细胞同质型黏附，并且不依赖于细胞间黏附分子、CD44，VLA4及白细胞功能相关抗原1（leukocyte function associated antigen1）等，细胞同型黏附在肿瘤血管转移的早期起重要作用［5］. 我们发现IFITM1可以使SW480细胞的异质型黏附力降低，其机制有待于进一步研究. I，II型IFN皆能诱导IFITM1表达，其mRNA水平呈百倍的升高. 并且能协同IFN抗肿瘤细胞增殖与细胞黏附，提高细胞对IFN的敏感性. Akyerli等［6］研究发现IFITM1的表达水平在慢性髓性白血病患者的低危组表达水平高，高危组表达水平较低；表达水平高的患者较表达水平低的患者预后好. 据此Akyerli等认为IFITM1可能是慢性髓性白血病患者预后的分子标志物. Ishii［7］等用佐剂诱导树突状细胞，发现IFITM1表达上调. 这些研究说明IFITM1基因具有多种生物学功能，值得进一步研究.

【参考文献】

［1］ Kita K, Sugaya S, Zhai L, et al. Involvement of LEU13 in interferoninduced refractoriness of human RSa cells to cell killing by X rays［J］. Radiat Res, 2003;160(3):302-308.

［2］ 黄勇,蒋建利,周筠,等. 稳定表达肝癌相关抗原HAb18G/CD147成纤维细胞株的建立及其意义［J］.第四军医大学学报, 2004;25(8)：673-676.

Huang Y,Jiang JL,Zhou J,et al. Construction of mouse fibroblast NIH/3T3 strain stably expressing HAb18G/ CD147 and its implication［J］. J Fourth Mil Med Univ, 2004;25(8)：673-676.

［3］ Martensen PM, Justesen J. Small ISGs coming forward［J］. J Interferon Cytokine Res, 2004; 24(1):1-19.

［4］ Glinsky VV, Glinsky GV, Glinskii OV, et al. Intravascular metastatic cancer cell homotypic aggregation at the sites of primary attachment to the endothelium［J］.Cancer Res, 2003;63(13):3805-3811.

［5］ Juang SH, Wei SJ, Hung YM, et al. IFNbeta induces caspasemediated apoptosis by disrupting mitochondria in human advanced stage colon cancer cell lines［J］. J Interferon Cytokine Res, 2004; 24(4):231-243.

［6］ Akyerli CB, Beksac M, Holko M, et al. Expression of IFITM1 in chronic myeloid leukemia patients［J］. Leuk Res,2005;29(3):283-286.

［7］ Ishii K, KuritaTaniguchi M, Aoki M, et al. Geneinducing program of human dendritic cells in response to BCG cellwall skeleton (CWS), which reflects adjuvancy required for tumor immunotherapy ［J］. Immunol Lett, 2005; 98(2):280-290.