基于SCAR分子标记的头花蓼分子鉴定研究

[摘要] 目的：建立快速准确的头花蓼与尼泊尔蓼药材的分子标记鉴定方法。方法：通过RAPD随机引物筛选，获得头花蓼特异的RAPD 分子标记片段，经克隆、测序，重新设计特异性引物转化形成稳定的SCAR标记。结果：获得2条稳定扩增的头花蓼特异片段Z300，Z1100，根据该2特异片段序列设计4对特异引物，分别对头花蓼与尼泊尔蓼药材DNA进行扩增，其中引物Z1-2可从头花蓼药材中扩增获得约300 bp 的片段，而尼泊尔蓼药材则未扩增出该片段。结论：引物Z1-2成功将Z300片段转化为SCAR分子标记，可作为头花蓼与近缘种尼泊尔蓼药材分子鉴定的依据。

[关键词] 头花蓼；尼泊尔蓼；近缘种；SCAR 标记

[收稿日期] 2012-12-21

[基金项目] 国家“十一五”科技支撑计划项目（2009BA174B01）；贵州省教育厅自然科学研究项目（黔教科2008026）；科技创新公共技术平台建设项目（2010筑科合字第3-2号）

[通信作者] *周涛，教授，研究方向为分子生药学，E-mail： 头花蓼 Polygonum capitatum Buch-Ham.ex D.Don和尼泊尔蓼 P. nepalense Meisn.均为蓼科蓼属头状蓼组植物（Sect. Cephalophilon Meisn.）[1]，其药用具有地区性，在我国西南地区多用于治疗风湿痹痛等疾病[2]。其中，头花蓼自20世纪90年代以来，作为贵州特色苗药的代表，既是多个治疗泌尿道感染的中成药制剂原料[3-4]，也建立了GAP的规范化种植基地，开展了种质资源评价与优良种源筛选工作。但就目前而言，头花蓼的栽培资源尚难以满足产品对原料的需求，野生资源仍是其药材主要来源，由于头花蓼以全草类入药，药材干燥皱缩，极易破碎，在头花蓼药材的市场收购中，出现了同属近缘种如尼泊尔蓼植物掺混现象，造成头花蓼药材使用混淆。从头花蓼、尼泊尔蓼的本草、临床使用来看[2]，二者虽多用于治疗风湿痹痛等疾病，但在功能与主治上有不同侧重点，头花蓼功效上偏重于利尿通淋，主要治疗泌尿道感染、肾盂肾炎；尼泊尔蓼则偏重于治疗风湿痹痛之症，主要用于咽喉肿痛、赤白痢疾、风湿痹痛等症。因此，准确鉴定头花蓼药材，避免采收、生产上的伪品掺杂是确保头花蓼临床疗效可靠的关键。

近年来，运用DNA分子标记方法开展中药材品种鉴定、药用植物种质资源评价及其辅助育种等方面的研究已有大量报道[5-6]。序列特异扩增区域（sequence charactered amplified region）标记技术即是在随机扩增多态性RAPD（randomly amplified polymorphic DNA）技术基础上发展起来的一种可靠、稳定的分子标记，它是基于对基因组进行RAPD分析后，将RAPD目标片段进行克隆测序，再对片段设计特定引物，以此引物对基因组DNA再进行PCR特异扩增，可将与RAPD片段相对应的单一位点鉴别出来[7-12]。SCAR标记具有更高的重现性，克服了RAPD重复性欠佳的弱点，并可以将显性标记转化为共显性标记[13]，可借鉴应用于传统性状鉴定、理化鉴定等方法难以解决的皱缩、破碎全草类中药材的近缘品种鉴定中。本文在RAPD分析工作的基础上，采用SCAR 标记技术建立快速准确的头花蓼DNA分子标记方法，为准确鉴定头花蓼与近缘种尼泊尔蓼的破碎药材、粉末药材提供一种新方法。

1 材料和方法

1.1 材料 2008年采集不同产地头花蓼、尼泊尔蓼叶片，每个种分别有 10 株新鲜植株个体，硅胶迅速干燥保存。头花蓼、尼泊尔蓼均经贵阳中医学院江维克教授鉴定。材料见表1。

1.2 DNA提取与检测 改良CTAB法。取DNA提取液各5 μL经1.0%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，SYNGENE型凝胶成像系统检测照相。

表1 供试材料来源

Table 1 Materials used in test

注：1～10：头花蓼 Polygonum capitatum ；11～20：尼泊尔蓼 P. nepalense 。扩增。反应体系包括：模板DNA 1 μL（100 mmol·L-1），2× Taq PCR MasterMix 13 μL （10 mmol·L-1），RAPD引物（10 pmol·L-1 ）1 μL，加入ddH2O补齐到25 μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，47 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，循环40次；72 ℃后延伸7 min。反应结果后，取PCR反应液各5 μL经1.2 %琼脂糖凝胶电泳1 h，溴化乙锭染色，SYNGENE型凝胶成像系统检测照相，见图1。

1.3 RAPD-PCR反应体系与反应条 本文从75个RAPD引物中筛选出18个条带清晰、多态性好的引物对头花蓼和尼泊尔蓼基因组DNA进行PCR M.Marker；1～18引物.C29，C39，C53，C56，C65，C72，C73，C76，C79，D01，D08，D18，D26，D40，D41，D43，D44，D46。

图1 18条RAPD引物

Fig.1 The PCR of 18 RAPD primers of Polygonum capitatum 1.4 RAPD产物特异片段的回收 电泳结果发现，引物C29（5′-GAGAACGCTG-3′）能在相对分子质量300 bp和1 100 bp左右处扩增出2条特异性条带，分别命名为Z300，Z1100。在紫外灯下切下Z300，Z1100目的片段，用TaKaRa公司的凝胶回收试剂盒分别回收、纯化，得到2条纯化条带，见图2。

M.Marker；1.头花蓼；2.尼泊尔蓼。

图2 随机引物C29筛选出头花蓼的特异片段

Fig.2 The specific band of Polygonum capitatum from P. nepalense was screened by the random primer C291.5 连接和转化 回收的Z300，Z1100片段用pMD19-T vector载体连接，转化导入由大肠杆菌DH-52 α 所制的感受态细胞中，采用蓝白斑筛选法获得克隆。应用菌落PCR和质粒提取检测的方法确定阳性克隆。

1.6 DNA序列测定 将筛选得到的阳性克隆制备成为穿刺菌，送到北京三博生物技术公司进行测序。所用测序引物为M13+：CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC，Rv-M13_： GAGCGGATAACAATTTCACACAGG。为了保证序列的准确性，对2个片段序列进行双向测定并加以校准。Z300全长为302 bp，Z1100全长为1 056 bp。在NCBI上对2个片段序列进行blastn搜索，未发现同源序列。序列见图3，4。

图3 头花蓼特异片段Z300的序列

Fig.3 The specific sequence of Z300 of Polygonum capitatum

1.7 SCAR引物的设计与SCAR-PCR扩增 根据测序结果和引物设计原则，应用Primer 5.0引物设计软件，在RAPD引物基础上向内延长8～12 bp，设计合成了4对大小为19～20 bp的特异引物，由上

图4 头花蓼特异片段Z1100的序列

Fig.4 The specific sequence of Z1100 of Polygonum capitatum

海生工生物工程技术服务有限公司合成。分别用设计的4对引物对头花蓼、尼泊尔蓼基因组DNA进行PCR扩增。实验对反应体系的组成及扩增时各循环参数进行了方法学考察，确定4对引物通用的PCR反应体系为：模板DNA 1 μL，dNTPMix 13 μL（10 mmol·L-1）引物（10 pmol·L-1）上下游各1 μL，加入ddH2O补齐到25 μL。PCR扩增反应条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性1 min，退火45 s，72 ℃延伸1.5 min，循环40次；72 ℃后延伸7 min。各引物的退火温度见表2。取PCR反应液各5 μL经1.2 %琼脂糖凝胶电泳1 h，溴化乙锭染色，SYNGENE型凝胶成像系统检测照相。见表2。

表2 头花蓼SCAR-PCR的引物序列

Table 2 The SCAR-PCR primers sequence of Polygonum capitatum

2 结果

实验显示，Z300片段测序后，依据该序列设计的4对特异性引物中，Z1-2号引物可在头花蓼中扩增获得约300 bp的片段，而尼泊尔蓼未出现该条带，即Z1-2号引物可以快速、稳定的鉴定出头花蓼，而Z1-1，Z2-1，Z2-2引物未能有效区分头花蓼与尼泊尔蓼。为了进一步验证Z1-2号引物作为SCAR标记引物的准确性和广泛适用性，分别对采自不同地区居群头花蓼和尼泊尔蓼药材的基因组DNA进行扩增。结果头花蓼都能扩增出300 bp的特征带，而尼泊尔蓼未能扩增出任何条带。PCR结果表明所筛选的SCAR标记特异性好，稳定可靠，操作简单，对于鉴别头花蓼和尼泊尔蓼是有效的标记方法，见图5。

M.Marker；1～10.头花蓼；11～20.尼泊尔蓼；21.阴性对照。

图5 不同居群头花蓼的SCAR标记

Fig.5 The SCAR marker of Polygonum capitatum in different populations

3 讨论

中药传统的表型鉴定易受生长发育、环境因素以及加工炮制影响而使一些近缘药材、伪药材不易被准确鉴定，而DNA分子标记技术具有快速、微量、特异性强、准确可靠等特点，不受生物体生长发育阶段、供试部位、环境条件、贮藏等因素的影响，在药用动、植物分类、遗传多样性研究与种质资源评价，中药材的鉴定与道地性研究等方面展示了广阔的应用前景[12-14]。

SCAR标记成本低廉，操作简单方便，适合于近缘种的快速分析[13-14]。但通常情况下，SCAR标记转换的成功率是很低的[13]，这也是目前发展SCAR标记的一个主要困难，在进行转换的过程中，将RAPD转化为SCAR标记并不是理想中那么容易，其中只有一部分可以完成这一转变，如本文在RAPD扩增中，虽获得2个特异性片段，但只有其中1个片段被成功转化为 SCAR 标记。

本文在多次调整实验条件的基础上，成功建立了头花蓼药材的SCAR标记，所设计的Z1-2号引物能清晰扩增获得头花蓼300 bp的DNA条带，特异性和重复性较好，解决了RAPD标记不稳定和高成本的问题，为头花蓼破碎药材的鉴定提供了一种新方法。

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Study on sequence characterized amplified region （SCAR）

markers of Polygonum capitatum

ZHOU Tao XIE Yu ZHANG Li-yan 1， WEI Sheng-hua， JIN Yan-lei1

（1. Guiyang college of Traditional Chinese Medicine， Guiyang 550002， China；

2. Cuizhou Weimen Pharmaceutical Co.， Ltd.， Guiyang 550018， China）

[Abstract] Objective： To establish sequence characterized amplified region markers of Polygonum capitatum . Method： The random primer was screened through RAPD to obtain the specific RAPD marker band， and the band was separated， extracted， cloned and sequenced. The specific primers were designed for conventional PCR reaction on the basis of the specific band， and the SCAR marker was acquired. Result： Screening from 50 RAPD primer， only C29 primer had 2 specific bands could distinguish P. capitatum from P. nepalense ， then 4 pairs of specific primers were designed based on the 2 sequences of RAPD marker bands， and only 1 pair primer （Z1-2） was successfully converted into SCAR marker after repeated tests. Conclusion： The Z1-2 primer could be used as an effective SCAR mark to identify Z300 DNA for P. capitatum . The SCAR mark was established and can be used as a molecular marker to distinguish P. capitatum from P. nepalense

[Key words] Polygonum capitatum ； Polygonum nepalense ； relative species； SCAR marker

doi：10.4268/cjcmm20131606