基于“组分结构”理论对丹皮、赤芍和白芍化学成分的对比研究

[摘要]基于“组分结构”理论对丹皮、赤芍与白芍化学成分进行分析比较。采用HPLCDAD技术，分析了13批丹皮，14批不同产地的赤芍与10批不同产地的白芍药材，并运用聚类分析，主成分分析等分析方法进行分析；利用F检验考察了丹皮、赤芍与白芍主成分间的显著性差异程度。建立了13批丹皮、14批赤芍与10批白芍药材的高效液相色谱指纹图谱，指认了7个萜苷类和酚酸类成分，根据系统聚类分析、主成分分析的结果，并结合“组分结构”理论对丹皮、赤芍与白芍进行对比研究。丹皮、赤芍与白芍功效不同，通过试验比较研究丹皮、赤芍与白芍中的主要化学成分的质量分数及其配比，发现存在显著性差异。

[关键词]丹皮；赤芍；白芍；指纹图谱；主成分分析；组分结构

[Abstract]To analyze and compare the chemical compositions of Moutan Cortex， Paeoniae Rubra Radix and Paeoniae Alba Radix based on "component structure" theory Thirteen batches of Moutan Cortex， 14 batches of Paeoniae Rubra Radix from different origins and 10 batches of Paeoniae Alba Radix from different origins were analyzed by HPLCDAD method Hierarchical cluster analysis and principal component analysis were used for analysis The significant differences of principal component from Moutan Cortex， Paeoniae Rubra Radix and Paeoniae Alba Radix were investigated by using F test HPLC fingerprints were established for 13 batches of Moutan Cortex， 14 batches of Paeoniae Rubra Radix and 10 batches of Paeoniae Alba Radix， and 7 glycosides and phenolic acids components were identified Comparative study of Moutan Coetex， Paeoniae Rubra Radix and Paeoniae Alba Radix was conducted according to the results of hierarchical cluster analysis， principal component analysis and "component structure" theory Moutan Cortex， Paeoniae Rubra Radix and Paeoniae Alba Radix have significant differences in mass fraction of major chemical components and their ratios， leading to different curative effects

[Key words]Moutan Cortex； Paeoniae Rubra Radix； Paeoniae Alba Radix； fingerprint； component structure； principal component analysis

doi：10.4268/cjcmm20161012

丹皮、赤芍与白芍均是临床上常用的中药。丹皮为毛茛科植物牡丹皮Paeonia suffruticosa Andr的干燥根皮，具有清热凉血，活血化瘀功效[1]。赤芍为毛茛科植物芍药P. lactiflora Pall或川赤芍P. veitchii Lynch的干燥根，具有清热凉血，散瘀止痛功效[1]。白芍为毛茛科植物芍药P. lactiflora Pall的干燥根，具有养血调经，敛阴止汗，柔肝止痛，平抑肝阳功效[1]。2015年版《中国药典》中含有丹皮的中成药共计79余种，如活血止痛膏、养阴清肺丸、六味地黄丸等；含有赤芍的中成药共计89种之余，如血府逐淤口服液、脑心通胶囊、少腹逐瘀丸等；含有白芍的中成药共计190余种，如调经养血丸、益血生胶囊、养血清脑丸等。现代研究表明，丹皮具有广泛的抗炎[2]、抗氧化[3]作用，是治疗心血管疾病的传统中药；赤芍具有抗氧化[4]、改善心血管[5]、抗炎[6]等作用；白芍具有补血[7]、抗炎镇痛[8]、抗抑郁[9]等功效。丹皮、赤芍与白芍均含有没食子酸、氧化芍药苷、芍药苷、苯甲酰芍药苷及丹皮酚等成分[1011]，但其功效却存在差异。目前，丹皮、赤芍与白芍的质量控制方法均较简单，2015年版《中国药典》规定丹皮中丹皮酚（C9H10O3）不得少于12%，赤芍中含芍药苷（C23H28O11）不得少于18%，白芍中含芍药苷（C23H28O11）不得少于16%[1]，目前针对丹皮、赤芍、白芍的研究主要集中在应用HPLC，UPLC等分析方法对丹皮酚、芍药苷、芍药内酯苷及没食子酸等指标性成分的含量进行测定。近年来，有文献报道运用聚类分析及相似度分析等[12]方法进行研究，然而均是简单地对药材进行相似性比对，并未阐明药材间的本质差异。本研究借助现代分析方法，并结合“组分结构”理论的思想对丹皮、赤芍、白芍间的差异进一步进行阐述。

中药物质基础是由多成分构成的，且多种成分并不是简单的堆积，而是一个有序的整体，相似的成分按照特定的比例构成了组分，不同组分又按照一定的比例构成了中药的整体[13]。笔者认为丹皮、赤芍、白芍中各组分的配比及组分中各成分的“量比结构”差异可能是导致其疗效差异的本质原因。本研究应用HPLC对13批丹皮药材，14批赤芍药材，10批白芍药材进行分析，建立了相应的指纹图谱，通过层次聚类分析法及主成分分析法分析丹皮、赤芍与白芍药材产地与药材质量的相关性；并筛选丹皮、赤芍、白芍的主成分，结合“组分结构”理论对丹皮、赤芍、白芍的质量进行分析和评价，为建立科学、合理的丹皮、赤芍、白芍药材质量评价方法提供依据。

1材料

Agilent 1200系列高效液相色谱仪（包括DAD、四元泵、自动进样器、柱温箱和在线脱气机），Agilent Chem station工作站；AL204电子天平（梅特勒托利多科学仪器有限公司）；Mettler Toledo AB135S分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；SK250HP超声仪（上海科导超声仪器有限公司）；MilliQ超纯水机（美国Millipore公司）；乙腈和纯水（HPLC级），其他试剂均为分析纯。丹皮、赤芍和白芍药材由江苏省中西医结合医院、四川成都中川中药饮片有限公司以及安徽滕王药业提供，经南京中医药大学药学院吴德康教授鉴定为安徽、山西、新疆等地药材，具体的药材编号及产地见表1。

2方法与结果

21色谱条件

Hedera ODS2色谱柱（46 mm×250 mm，5 μm），流动相乙腈（A）01%甲酸（B），梯度洗脱（0～20 min，5%～10%A；20～30 min，10%A；30～80 min，10%～18%；80～120 min，18%～50%A），流速08 mL・min1，检测波长254 nm，柱温25 ℃，进样量10 μL。

22对照品溶液的制备

精密称取没食子酸153 mg，氧化芍药苷102 mg，芍药内酯苷222 mg，芍药苷313 mg，五没食子酰葡萄糖221 mg，苯甲酰芍药苷133 mg，丹皮酚259 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，备用。

23供试品溶液的制备

分别称取丹皮、赤芍、白芍药材粉末约05 g，精密称定，置于25 mL量瓶中，加甲醇定容，超声处理30 min，放置室温，定容至刻度，摇匀，045 μm有机微孔滤膜滤过，取续滤液备用。

24参照峰的选择

各批次丹皮、赤芍和白芍指纹图谱中以6号峰芍药苷的峰面积适中，分离度较好且为共有峰，因此将6号色谱峰芍药苷确定为参照峰S。

25方法学考察

251精密度试验精密吸取同一批样品供试品溶液，按23项下方法制备供试品溶液，按21项下的色谱条件连续进样6次，以参比峰的保留时间和峰面积为参照，测得各峰相对保留时间RSD均小于030%，相对峰面积的RSD均小于16%，表明仪器精密度良好。

252重复性试验称取同一批样品6份，按23项下操作制备供试品，按21项下色谱条件进样，测得各峰相对保留时间RSD均小于028%，各峰相对峰面积的RSD均小于17%，表明样品处理方法的重复性良好。

253稳定性试验精密吸取取同一供试品溶液，按21项下色谱条件分别在0，2，4，6，8，12，24 h进样测定，测得各峰的相对保留时间RSD均小于037%，各峰的相对峰面积RSD均小于22%，表明样品溶液在24 h内稳定。

254加样回收率试验精密称取已测定的药材样品9份，每组分别加入相当于药材样品量80%，100%，120% 3个质量浓度水平的对照品溶液，按23项下方法制备供试品溶液， 21项下色谱条件进样检测，计算各对照品的平均加样回收率，结果氧化芍药苷为1023%，RSD为17%；芍药内酯苷为9879%，RSD为11%；芍药苷为1017%，RSD为16%；五没食子酰葡萄糖为9887%，RSD为13%；丹皮酚为1019%，RSD为16%。

3结果

31丹皮、赤芍与白芍特征指纹谱的建立和识别

本研究测定了13批丹皮、14批赤芍和10批白芍样品，其代表性的特征指纹图谱见图1，共获得15个色谱峰，经与对照品对照，指认了7个主要的色谱峰，分别为没食子酸（1号峰），氧化芍药苷（4号峰），芍药内酯苷（5号峰），芍药苷（6号峰），五没食子酰葡萄糖（9号峰），苯甲酰芍药苷（13号峰），丹皮酚（15号峰）。

32丹皮、赤芍和白芍聚类分析

系统聚类分析是一种无管理、无指导的化学模式识别方法，是根据事物本身的特征研究个体分类的方法，可依据所测样品的色谱指纹图谱特征数据，对样品进行分类[14]。以13批丹皮，14批赤芍，10批白芍为研究对象，获得具有15个色谱峰的特征指纹图谱，以15个色谱峰峰面积作为指标，运用SPSS 160软件对13批丹皮、14批赤芍和10批白芍药材进行层次聚类，运用组间平均数联结法，以夹角余弦值作为样品相似度距离公式，对样品进行系统聚类分析，结果见图 2。聚类分析首先将样品分为丹皮、赤芍、白芍3大类，其次又将丹皮分为3类，S9，S13为一类，S1，S2，S3，S5，S4，S12为一类，S7，S10，S8，S6，S11为一类；白芍分为2类，S36，S37，S33，S28，S34，S32，S35，S30，S31为一类，S29为一类，赤芍分为4类，S26，S27，S18为一类，是S17，S21为一类，S16，S25，S19，S15为一类，S20，S24，S22，S23，S14为一类。

33丹皮、赤芍与白芍药材主成分分析

用SPSS 160软件对3种药材进行主成分分析，将不同产地的丹皮、赤芍、白芍药材作为变量，结果见图3，发现药材划分为3类，分类结果如聚类分析一致。再将13批丹皮药材、14批赤芍药材及10批白芍药材分别进行主成分分析，探索3种药材各自的主要成分。以15个峰的峰面积作为变量，依据主成分的特征值大于1及累积方差贡献率大于75%的原则进行筛选。丹皮、赤芍、白芍主成分分析中均提取特征值大于1的前5个成分，累计贡献率分别为85405%，78390%，86147%，各药材中的 15个峰旋转后的因子载荷矩阵及得分系数分别见表2～4。丹皮、赤芍、白芍5个主成分中，第一主成分是特征值最大的，是“信息量”最多的峰，第一主成分中得分系数的大小反映了指标成分贡献率的大小，其中丹皮第一主成分的前5名变量系数对应指纹图谱的色谱峰分别是1，9，6，4，15号峰；赤芍第一主成分的前5名变量系数对应指纹图谱的色谱峰分别是6，11，2，5，9号峰；白芍第一主成分的前5名变量系数对应指纹图谱的色谱峰分别是9，8，4，5，6号峰。从对照品色谱图可知，6号峰为芍药苷，5号峰为芍药内酯苷，9号峰为五没食子酰葡萄糖，4号峰为氧化芍药苷，15号峰为丹皮酚，2，11，8号峰为未知成分需要进一步的分析确证。

按23项下供试品溶液的制备方法，制备不同产地丹皮、赤芍和白芍供试品溶液，测定5种主成分的量，并对丹皮、赤芍和白芍提取物中5种主成分质量分数构成进行比较分析，结果见表5，并利用SPSS 160对不同产地丹皮、赤芍和白芍药材中氧化芍药苷，芍药内酯苷，芍药苷，五没食子酰葡萄糖，丹皮酚的质量分数数据进行显著性差异分析，结果见表6。当P

主成分分析筛选出3个萜苷成分和3个酚酸成分，分别将其归为萜苷组分（氧化芍药苷、芍药苷、芍药内酯苷）和酚酸组分（没食子酸、五没食子酰葡萄糖、丹皮酚），其中丹皮萜苷组分结构为氧化芍药苷芍药内酯苷芍药苷为（0026%～0156%）∶（0%～0073%）∶（0352%～1085%）；酚酸组分结构为没食子酸五没食子酰葡萄糖丹皮酚为（0102 8%～0285 3%）∶（0299%～0684%）∶（0828%～1773%）；赤芍萜苷组分结构为氧化芍药苷芍药内酯苷芍药苷为（0005%～0077%）∶（0%～177%）∶（1822%～2962%），酚酸类组分结构为没食子酸五没食子酰葡萄糖丹皮酚为（0029 2%～0229%）∶（0269%～0406%）∶（0018%～0060%）；白芍萜苷组分结构为氧化芍药苷芍药内酯苷芍药苷为（0011%～0057%）∶（1096%～2061%）∶（0563%～1949%）；酚酸组分没食子酸五没食子酰葡萄糖丹皮酚为（0074%～0198%）∶（0187%～0401%）∶（0005%～0032%）。丹皮，赤芍，白芍中萜苷组分及酚酸组分结构配比存在显著性差异，这可能是导致丹皮、赤芍、白芍疗效差异的主要原因之一。丹皮、赤芍，白芍属于同科芍药属植物，含有相似的化学成分，但其主治功效却明显不同，该研究结果提示丹皮，赤芍，白芍中各组分结构可能存在特定的“化学成分配比” ，从而导致其功效不同。因此，应该根据药材中各组分特定的“成分配比”关系对丹皮，赤芍，白芍药材进行更为科学的质量控制。

4讨论

丹皮、赤芍、白芍均属于毛茛科芍药属植物的根，含有的化学成分类似，目前尚未发现能够区分三者的特有化合物，然而，其功效存在明显的差异，白芍的补血功效明显优于赤芍[15]，白芍总提物对抑制炎性水肿和炎性渗出均有很好的效果，而在抑制血小板聚集方面，赤芍总提物的作用明显优于白芍总提物[16]，丹皮则具有降血糖、抗菌消炎的作用[17]。分析其原因主要有两方面：首先，丹皮、赤芍、白芍均为毛茛科芍药属植物的干燥根，但生长环境及加工方法不同，可能是导致丹皮、赤芍、白芍成分质量分数差异较大的主观原因。此外，影响中药疗效差异的因素很大程度上取决于中药“组分结构”的差异。“组分结构”是指中药是一个复杂且有序的整体，含有多种有效成分协同发挥药效，各成分的疗效贡献度不同，但各成分之间存在最佳的配比范围，使得药物整体发挥最大的疗效，此时的成分构成为该中药的“组分结构”。丹皮、赤芍、白芍化学成分虽类似，但其“组分结构”却存在明显的差异。

本研究建立了评价丹皮、赤芍、白芍药材质量的液相色谱特征指纹图谱分析方法，运用聚类分析及主成分分析等现代化计算机辅助手段，明确丹皮、赤芍、白芍药材中的主成分，并将其主成分质量分数进行显著性差异分析，结合“组分结构” 理论思想，可以看出药材中各组分内的成分配比存在明显的不同，其可能是导致丹皮、赤芍、白芍功效差异的客观原因。药材间药效的差异往往归因于药材质量的影响，因此，基于组分/成分量的配比关系的“组分结构”成为药材质量控制的关键。通过现代分析技术及药理药效试验筛选及优化药材中的有效成分的配比，确定药材中各有效成分的最优配比范围，根据最优配比范围控制中药的质量，使中药的药效物质结构更明确，使中药质量控制体系更合理、更科学。

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