DNA检测在宫颈鳞癌中的运用

本文作者：李 岩 崔竹梅 娄艳辉 刘丽芝 唐 蕊 韩汶君 单位：青岛大学医学院附属医院妇科

高危型人类瘤病毒(high-riskhumanpapil-lomavirus，HR-HPV)与宫颈癌前病变及宫颈癌密切相关，流行病学和分子生物学研究都证明，HR-HPV持续感染是宫颈癌及宫颈上皮内瘤变(cervicalin-traepithelialneoplasia，CIN)发生的重要因素［1］，宫颈癌中HPV检出率可高达99．7%［2］。所以HR-HPVDNA检测不仅被广泛应用于宫颈疾病筛查中，而且也常用于宫颈癌及其癌前病变的治疗后随访。宫颈冷刀锥切术(coldknifeconization，CKC)是一种古老而传统的诊治CIN及早期宫颈癌的手术方法。宫颈锥切术后患者宫颈病变复发或进展为浸润性宫颈癌的几率仍明显高于普通人群，因此术后随访监测十分重要。宫颈锥切术在切除病灶的同时，也可有效清除HPV感染，但报道仍有14．0%～27．1%的患者术后存在HPV持续感染［3－5］，而HR-HPV持续感染是宫颈锥切术后病变持续或复发的重要因素［4－8］。本文通过分析宫颈锥切术后HR-HPV持续感染及病变持续或复发的相关因素，为随访中有的放矢、重点排查提供依据，以节约医疗资源。

1资料与方法

1．1研究对象选择2008年1月至2010年10月在青岛大学医学院附属医院妇科因CINⅡ～Ⅲ或宫颈鳞癌(ⅠA1期)行宫颈冷刀锥切术治疗的308例患者。其中CINⅡ42例(13．6%)，CINⅢ218例(70．8%)，宫颈鳞癌(ⅠA1期)48例(15．6%)。术前HR-HPV阳性率为95．5%(294/308)，在CINⅡ、CINⅢ、宫颈鳞癌(ⅠA1期)中，HPV阳性率分别为85．7%(36/42)、96．3%(210/218)、100%(48/48)。患者年龄22～66岁，平均38．4岁，均有性生活史及妊娠史，16例无分娩史，排除合并慢性疾病及免疫抑制性疾病者。所有患者均经宫颈液基细胞学、阴道镜检查及阴道镜下多点活检病理组织学检查明确诊断，术前采用HC2法行HR-HPVDNA检测;锥切病理标本病变未累及切缘及锥顶(早期宫颈鳞癌者无淋巴血管间隙受累);术后应用HR-HPVDNA检测联合液基细胞学检查进行随访。

1．2研究方法

1．2．1薄层液基细胞学检查(thin-layerliquid-basedcytolo-gy，LCT)用AutoCyte液基薄层细胞学技术(美国TripathImaging)行宫颈细胞学检查，采用2001年TBS分类系统(thebethesdasystem)进行诊断。

1．2．2HR-HPVDNA检测采用美国Digene公司提供的第二代杂交捕获实验(hybridcapture2，HC2)技术检查宫颈分泌物标本中HPVDNA含量，采用96孔平板法，可一次检测13种HR-HPV(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68型)。标本的RIUs/CO值≥1．0为阳性，本研究根据Immaculada等研究分类［3－5］，分别取100、500、1000为截断值进行研究。

1．2．3宫颈冷刀锥切术所有入选患者均在静脉复合麻醉下行宫颈冷刀锥切术，手术范围:切除宽度应在碘染宫颈不着色边缘外0．5cm，锥切顶应达宫颈管2．0～2．5cm。锥切标本送检行病理检查。

1．2．4锥切标本组织学处理经10%中尔马林充分固定，自锥切宫颈12点顺时针连续取材及锥顶处取材。记录锥切宫颈各点的诊断情况，切缘及锥顶有无病灶残留、间质有无侵犯及宫颈腺体受累情况等。

1．2．5宫颈锥切术后随访宫颈锥切术后均行严密随访，随访时间最短1年，最长3．8年，平均随访时间2．9年。术后1个月随访，观察阴道分泌物、宫颈创面愈合情况及月经情况。术后每3～6个月用液基细胞学联合HR-HPVDNA检测随访，连续3次正常后改为每年随访1次;如细胞学阴性、HR-HPVDNA检测阳性，6个月后复查HR-HPVDNA检测;如细胞学为ASCUS、HR-HPVDNA检测阴性，3个月后复查液基细胞学;如细胞学为AS-CUS、HR-HPVDNA检测阳性或细胞学＞ASCUS，则行阴道镜下多点活检，根据病理结果作相应处理。

1．2．6宫颈锥切术疗效判定［9］宫颈锥切术后1年内发现CIN称病灶持续存在;手术后连续3次宫颈细胞学检查均正常后(间隔3～6个月)发现CIN则称为复发。所有病变持续及复发均经病理组织学证实。

1．3统计学分析用SPSS17．0统计软件处理分析数据。采用卡方检验进行统计分析，采用logistic回归进行多变量因素分析，以P＜0．05为差异有统计学意义。

2结果

2．1宫颈锥切术后HR-HPV持续感染与宫颈病变复发的关系308例患者术后均行严密随访，术后HR-HPV阳性持续大于12个月定为持续感染。宫颈锥切术后HR-HPV持续阳性者58例(18．8%)，HR-HPV转阴者250例(81．2%)。宫颈锥切术后病变持续或复发者10例(3．25%)，其中9例为术后HR-HPVDNA持续感染者，占15．5%(9/58);1例为术后HR-HPV转阴者，占0．4%(1/250)。病变持续或复发在术后HR-HPV持续阳性组和转阴组中的差异有显著统计学意义(P＜0．001，Fisher精确检验)。10例病变持续或复发者中，宫颈鳞状细胞癌2例，阴道癌1例，VAINⅢ1例，CINⅡ2例，CINⅠ4例。3例密切随访者未见疾病进展及消退，HR-HPV持续阳性;5例再次治疗后细胞学检查随访正常，HR-HPV转阴;2例转外院治疗，失访。见表1。

2．2宫颈锥切术后HR-HPV持续感染的相关因素单变量因素分析结果显示，术前HR-HPVDNA高负荷者(≥100RIUs/CO，P＜0．001;≥500RIUs/CO，P=0．026;≥1000RIUs/CO，P=0．010)、宫颈病变累及3～4个象限者(P=0．036)在术后HR-HPV持续阳性组中明显多于术后转阴组，考虑可能是术后HR-HPV持续感染的相关因素;而年龄(P=0．176)、绝经与否(P=0．753)、产次(P=0．866)、病变级别(P=0．823)和宫颈腺体受累(P=0．827)与术后HR-HPV持续感染无关。将年龄、绝经、产次、宫颈腺体受累情况、多象限病变、病变级别及术前HR-HPVDNA≥100RIUs/CO等因素同时纳入lo-gistic回归分析，结果发现:术前HR-HPVDNA负荷量≥100RIUs/CO(P＜0．0001;OR=6．35;95%CI:2．94～13．73)、病变累及3～4个象限(P=0．011;OR=2．27;95%CI:1．20～4．27)是术后HR-HPV持续感染的独立危险因素。见表2。

2．3宫颈锥切术后病变持续或复发的相关因素单变量因素分析结果显示，只有术前HR-HPVDNA≥500RIUs/CO与术后病变持续或复发明显相关(P=0．036)。将年龄、绝经、产次、宫颈腺体受累情况、多象限病变、病变级别及术前HR-HPVDNA≥500RIUs/CO等因素同时纳入logistic回归分析，发现术前HR-HPVDNA负荷量≥500RIUs/CO(P=0．014;OR=5．53;95%CI:1．42～21．56)为宫颈锥切术后病变持续或复发的独立危险因素。见表2。

3讨论

本研究结果显示，宫颈锥切术后随访至少12个月，HR-HPV的阳性率由95．5%降至18．8%。HR-HPV持续感染是宫颈锥切术后病变持续或复发的重要因素(P＜0．001)。术前HR-HPVDNA高负荷是术后HR-HPV持续感染及病变持续或复发的独立危险因素。

3．1宫颈锥切术后HR-HPV清除情况关于宫颈锥切术后HR-HPV的清除情况，目前已有较多报道［4－6］，多数学者认为宫颈锥切术可有效地清除HPV感染。Kim等［6］研究认为，HPV感染有效清除多在宫颈锥切术6个月后，而12个月后HPV继续清除少见，故术后HR-HPVDNA检测应在术后6个月以后。本研究对宫颈锥切术后患者随访时间均大于12个月，HR-HPV持续阳性率为18．8%，可见尽管手术切除了病灶，却不能完全清除HPV感染。

3．2HR-HPVDNA检测在锥切术后随访中的价值以往研究表明，宫颈锥切术后即使在密切的细胞学检查随访下仍有部分患者出现病变复发或进展为浸润性癌。这意味着细胞学检查具有一定的假阴性，单纯细胞学随访不能有效地预防宫颈锥切术后患者宫颈癌的发生。越来越多的证据表明，宫颈锥切术后HR-HPV持续感染是病变持续或复发的高危因素［4－8］。许多学者认为，HR-HPVDNA检测宫颈锥切术后病变持续或复发的阴性预测值几乎可达100%，且与细胞学联合可提高检测的敏感性［7，8］。本研究中，宫颈锥切术后病变持续或复发共10例，其中9例为宫颈锥切术后HR-HPVDNA持续感染者，进一步证实HR-HPV持续感染是术后病变持续或复发的高危因素，故宫颈病变治疗后应重视HR-HPVDNA的检测。

3．3宫颈锥切术后HR-HPV持续感染及病变持续或复发的相关因素有关宫颈锥切术后HR-HPV持续感染及病变持续或复发的危险因素的报道研究很多，具有统计学意义的相关因素有年龄、产次、手术切缘状态、宫颈病变的级别、宫颈管搔刮阳性、多象限病变累及、宫颈腺体是否受累、术前HR-HPVDNA高负荷等，但各家报道结果不一。多项研究表明，术前HR-HPVDNA高负荷，不仅是术后HR-HPV持续感染的高危因素，而且预示术后病变持续或复发的风险性增加［3－6，10］。本研究也得出了相同的结论。Josefsson等［11］曾报道宫颈原位癌发生的危险性随HPV16DNA负荷量的升高而增加，考虑可能与机体遗传易感性及自身免疫力相关。根据以往研究报道，本文分别取100、500、1000为临界值进行研究，在预测术后HR-HPV持续感染时结果均显示有统计学意义，而在预测术后病变持续或复发时仅术前HR-HPVDNA≥500RIUs/CO具有统计学意义。可见术前HR-HPVDNA高负荷是宫颈锥切术后HR-HPV持续感染及病变持续或复发的危险因素，但临界值的选取确定尚需更大样本研究进一步证实。另外，通过单变量及多变量因素分析，病变累及3～4个象限也为术后HPV持续感染的高危因素，但与病变持续或复发无关。既往研究曾报道，多象限病变受累病变残留或复发的危险性增加［12，13］，本文研究复发病例较少，尚需更大样本研究进一步明确。年龄、产次、病变级别、宫颈腺体受累在预测锥切术后HR-HPV持续感染及疾病持续或复发方面争议较大［5，12，13］。本研究表明，年龄、产次、病变级别、宫颈腺体受累均与术后HR-HPV持续感染无关。总之，宫颈锥切术后即使切缘为阴性时仍有一定的HR-HPV感染率，表明手术治疗虽然切除了病变，但并不意味着完全消除了HPV感染。而HR-HPV的持续感染是宫颈锥切术后病变持续或复发的重要因素，故术后随访应重视HR-HPVDNA的检测。术前HR-HPVDNA高负荷、多象限病变受累是术后HR-HPV持续感染及病变持续或复发的危险因素，术后应密切随访。