神经营养因子3基因转染的施万细胞在脊髓损伤大鼠中的实验研究

[摘要] 目的 探讨神经营养因子3基因转染的施万细胞在脊髓损伤大鼠中的作用，以进一步了解其在脊髓损伤治疗中的应用价值。 方法 将90只健康Wistar大鼠采用Allen打击法建立脊髓损伤模型，将其随机分为A组（空白对照组）30只、B组（神经干细胞移植组）30只和C组（神经干细胞联合神经营养因子3基因转染的施万细胞移植组）30只。三组大鼠分别于移植前、移植后1、3个月进行BBB评分、皮质诱发电位及神经功能相关指标评估及比较。 结果 移植后1、3个月B组和C组的BBB评分中0～7分比例（B组：70%、60%，C组：50%、30%）、皮质诱发体感和运动电位[B组皮质诱发体感电位：（201.37±23.06）、（227.63±26.48）μV， C组皮质诱发体感电位：（241.36±27.34）、（278.53±31.46）μV；B组皮质诱发运动电位：（150.23±22.67）、（193.57±27.18）μV，C组皮质诱发运动电位：（186.72±26.83）、（242.57±30.56）μV]，均优于A组[90%、90%，皮质诱发体感电位：（53.86±6.75）、（56.96±7.35）μV，皮质诱发运动电位：（32.64±4.07）、（34.15±4.12）μV]。另外，B、C组神经功能相关指标也均明显优于A组，而C组则优于B组，且C组移植后3个月神经功能指标水平明显优于移植后1个月，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。 结论 神经营养因子3基因转染的施万细胞在脊髓损伤大鼠中的作用较佳，有利于脊髓损伤的改善，对改善患者的感觉、运动等指标均发挥着积极作用。

[关键词] 神经营养因子3基因转染；施万细胞；脊髓损伤；效果

[中图分类号] R651.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）04（a）-0023-04

脊髓损伤是临床重症，其对患者造成的损伤极为严重，可导致患者出现瘫痪等情况，极大地影响到患者的综合生存状态。近些年来较多研究显示，施万细胞移植对于脊髓损伤的治疗效果较佳，但是其也存在一定的不足，如作用不够持久、稳定等，因此对其进行进一步地改善极为重要[1]。神经营养因子3是国内外较受认可的一类对神经损伤修复营养效果较佳的营养物质，但是其效果还有进一步的提升空间。近些年来出现了一些关于神经营养因子3基因转染的施万细胞研究，认为其有效弥补了单用两者的不足，但也有一些研究认为其效果并不突出，应用价值不足。因此，对神经营养因子3基因转染的施万细胞进行研究的空间较大。本研究观察了神经营养因子3基因转染的施万细胞在脊髓损伤大鼠中的作用，现将结果总结分析并报道如下：

1 资料与方法

1.1 实验动物及分组

选取90只健康Wistar大鼠为研究对象，所有大鼠均购自军事医学科学院实验动物中心。将90只大鼠随机分为A组（空白对照组）、B组（神经干细胞移植组）和C组（神经干细胞联合神经营养因子3基因转染的施万细胞移植组）。A组30只大鼠中，雌雄各半，体重190～212 g，平均（204.1±6.3）g。B组30只大鼠中，雌雄各半，体重188～214 g，平均（204.6±6.2）g。C组30只大鼠中，雌雄各半，体重191～210 g，平均（204.4±6.5）g。三组大鼠性别及体重差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 模型制作 三组大鼠均采用Allen打击法制作脊髓损伤模型。大鼠采用腹腔注射方式麻醉，于其胸12部位进行皮肤与肌肉的切开处理，置于俯卧位，采用打击架进行打击处理，打击物重量为10.0 g，打击的高度为50.0 mm左右，每只大鼠均连续打击6次，至大鼠出现甩尾后模型制作完成。清洗切开的皮肤与肌肉，缝合处理，常规喂养，备用。

1.2.2 处理方法 A组为空白对照组，仅以10 μL培养液注入损伤部位，入针后分别从其损伤部位的头、尾部以斜45°角注入。B组进行神经干细胞移植，显露硬膜后，以单细胞注射器刺入损伤部位，将神经干细胞大约10 μL分别从损伤部位的头部与尾部注入，然后观察情况无异常后进行缝合。C组的处理方法与B组一致，但移植物为10 μL神经干细胞联合神经营养因子3基因转染的施万细胞。三组大鼠均注射治疗1次，并注意对损伤部位的保护。分别于移植前、移植后1、3个月每组取10只大鼠进行BBB评分、皮质诱发电位及神经功能相关指标的检测、评估及比较。

1.2.3 检测方法 皮质诱发电位的检测指标为皮质诱发体感和运动电位，均采用丹麦产2000M型双信道神经肌电描记仪进行检测，其中，检测过程中的刺激频率为10次/s，而时限与分析时间分别为100 μs与10 ms，注意避免可能引起测量误差的相关因素。神经功能相关指标检测项目为脊髓组织微管相关蛋白2（MAP-2）、神经生长因子（NGF）及脑源性神经营养因子（BDNF），取处死大鼠的脊髓组织，并以甲醛固定，进行相应的脱水及石蜡包埋处理，再将其以5 μm的规格切片，以免疫组化法进行处理及检测，并将标本置于高倍镜下阅片，进行阳性细胞数统计。由资深工作人员进行标本制作及阅片，每只大鼠制作4份切片，对其读数，取平均值。

1.3 评价标准

采用BBB评分对移植干预前后大鼠进行后肢功能评估。BBB评分是评估大鼠脊髓损伤的重要量表，其分值范围为0～21分，其中，0分表示可见到后肢运动，1～7分表示大鼠存在不同程度的后肢关节活动，活动的关节从少到多，由轻微活动到大幅度活动；8～16分表示大鼠后肢存在无、部分负重活动至持续负重行走，即表示爪面从轻微着地到可承重，承重重量从轻到重且可协调运动；17分及以上表示大鼠接近正常活动至运动功能正常[2]，即从不稳的协调运动到持续的协调运动，从而实现躯干的协调运动。

1.4 统计学方法

2.2 三组大鼠移植前后皮质诱发电位比较

3 讨论

脊髓损伤为神经外科的危急症之一，致残率较高，且不易改善恢复，患者常常有截瘫及四肢瘫痪等表现，严重影响患者的后期生存状态。因此，改善患者的脊髓损伤状态一直是临床研究的热点[3]。临床中以往较多的实验研究结果显示[4-5]，神经干细胞及施万细胞移植均是较佳的改善脊髓损伤的治疗方法，效果较为突出，但是疗效仍需改进、提升。施万细胞移植治疗的不足之处在于仍需进一步改进其脊髓神经的损伤修复作用，而NGF是近些年来应用于施万细胞修饰的研究热点，其中，神经营养因子3是研究较多的一类，其临床作用尚可[6-7]，但对于其综合优势的研究相对较少，也缺乏足够的相关论证。对于神经损伤的修复及治疗是一个缓慢的过程，需要治疗干预方法具有长久且稳定的效果。另外，对于脊髓损伤的治疗效果要保证运动与感觉等综合功能的改善，从而实现长久且全面发挥疗效的作用。这些方面是近些年来临床中对于干预效果有效程度评估的重要指标。

本文就神经营养因子3基因转染的施万细胞在脊髓损伤大鼠中的作用进行观察，并将干预的效果与空白对照大鼠及采用神经干细胞移植的大鼠进行比较。结果显示，神经营养因子3基因转染的施万细胞更有助于改善脊髓损伤大鼠的BBB评分、皮质诱发电位及神经功能相关指标，说明模型大鼠运动功能及神经功能均得到有效改善，从而肯定了神经营养因子3基因转染的施万细胞在脊髓损伤治疗中的效果，且其改善作用呈现持续稳定的状态，即移植前至移植后1、3个月这种改善持续进行，从而肯定了神经营养因子3基因转染的施万细胞在作用持久方面的效果。分析原因认为可能与神经营养因子3更有效地促进了施万细胞对于神经细胞的修复有关[8]。并且，神经营养因子3基因转染的施万细胞还具有有效控制神经元萎缩的功效，轴突再生得到有效促进[9-12]，故效果突出。另外，在神经受损后施万细胞开始分化，并有选择性地实现基因表达，从而为神经元的再生提供了必要前提，但这种效果不够突出稳定，需要进一步强化及稳定，而神经营养因子3则可对这些不足进行有效的弥补，从而实现其稳定且持久地发挥作用的目的。神经营养因子3还可以起到进一步增强神经元之间联系的作用，可以改善神经损伤部位的微环境。

综上所述，可以认为神经营养因子3基因转染的施万细胞既为神经损伤提供了必要的修复基础，又为其提供了较佳的修复改善环境，综合优势极为突出。本研究认为，神经营养因子3基因转染的施万细胞在脊髓损伤大鼠中的作用较佳，有利于脊髓损伤的改善，价值较高。

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（收稿日期：2013-02-18 本文编辑：程 铭）