艾滋病实验诊断进展

【摘要】 目前艾滋病的流行情况令人担忧，严重影响了社会经济发展，因此艾滋病的防治显得十分重要。为遏制艾滋病的传播和有效治疗艾滋病，除寻求更加有效的疫苗和治疗药物外，HIV感染的早期诊断非常重要，早期诊断有利于控制传染源及传播途径。早期诊断主要靠实验诊断，有免疫学抗体抗原检测、分子生物学核酸检测、分离培养、CD4 T细胞计数等。

【关键词】艾滋病；人类免疫缺陷病毒；实验诊断

【Abstract】 Now the popular circumstance of the AIDS make people worry.It seriously affected the social economic development.The prevention and cure that the AIDS seem to be very important.In order to suppress the dissemination of AIDS andvalidly treatAIDS,in addition to look for the more valid vaccine andmedicine for curing,HIV infection of earlier period examine a patient count for much,examined a patient to be important to control infection source and spread the path in early days.Examining a patient to mainly depend onexperimental examination in early days.There are the immunological antibody antigen examination,the molecular biological nucleic acid examination and separate development,the cells of CD4 T counted etc.

【Key words】AIDS; HIV; Experimental diagnoses

联合国艾滋病规划署和世界卫生组织联合报告指出，2006年全球艾滋病病毒携带者人数为3 950万；2006年新增艾滋病感染者430万，其中40％为15~24岁的年轻人；2006年全球有290万人死于艾滋病。

卫生部通报我国艾滋病的流行现状：截止至2006年10月31日,全国历年累计报告艾滋病感染者183 733例，其中艾滋病患者40 667例；死亡12 464例。感染者和患者人数增加，艾滋病疫情进一步蔓延的形势仍然严峻。

艾滋病的流行造成对健康的巨大危害和社会经济的破坏。国家非常重视艾滋病的防治工作， 出台了一系列艾滋病

防治管理的法规和措施，务求实效。寻求更加灵敏、特异、准确的检测方法是一项重要的工作。自1985年第一个艾滋病诊断试剂盒问世以来，艾滋病实验诊断技术有了很大的进步，下面就艾滋病实验诊断的进展作以下综述。

1 艾滋病病原简介

艾滋病的病原微生物是艾滋病病毒(HIV)，为带有包膜的RNA逆转录病毒，在分类上属于逆转录病毒科慢病毒属。HIV呈球形或卵形，直径100~130 nm，由包膜和核心两个部分组成。包膜蛋白包括外膜糖蛋白(gp120)和跨膜糖蛋白(gp41)，核心部分由核壳蛋白、两个相同拷贝的核酸基因组-RNA和酶类组成。CD4是HIV最重要的靶细胞，在CD4淋巴细胞内反转录酶将RNA逆转录成前病毒DNA， 接着整合到宿主细胞基因组DNA中，而后和细胞一起复制。

2 免疫学抗体抗原检测

2．1 抗体检测

HIV 抗体一般在感染4周后逐渐出现，可延至终身，是人类重要的检测指标，相比于近年来逐步发展起来的用免疫技术测定其感染因子，检测HIV特异性抗体仍是诊断艾滋病的重要依据[5]。

2．1．1 HIV抗体检测初筛实验

2．1．1．1 酶联免疫吸附实验(ELISA)法敏感性好且操作简便。目前酶免法测HIV抗体试剂已发展到第四代，市售试剂有荷兰生物梅里埃HIV-1/2抗体检测试剂、美国的雅培、上海科华、北京万泰等,其敏感度几乎100%，特异性在98．10~99．80%，并且适用于批量操作，缺点是有一定假阳性。

2．1．1．2 免疫荧光法(IFA)是借助抗体反应进行荧光染色的诊断技术，由于非特异荧光较难去除等缺点，因而仅用于HIV抗体初筛，阳性结果需经确证实验证实，该法操作简便、敏感性高、特异性比ELISA法高。

2．1．1．3 凝集实验具有不需任何设备，一步即可迅速得到结果的优点，敏感性和特异性与ELISA相近。缺点是有假阳性，且价格昂贵，亦仅作初筛实验。

2．1．1．4 在ELISA基础上发展起来的金免疫渗滤实验(GIFA),GIFA始于1985年，最初以酶作为标记物，1989年发展以胶体金为标记物用于检测艾滋病毒抗体的渗滤实验[9]。1990年Oskiowicz等应用硒作为标记物建立了免疫层析实验。上述2种方法具有快速、简单，不需要任何仪器设备，几分钟可用肉眼观察结果的优点，目前在临床检测中已广泛应用。

2．1．2 确证实验

2．1．2．1 免疫印迹实验(WB)WB是目前最特异、敏感的证实HIV感染的方法，也是国内HIV确认的首选方法。WB实验能检测到gp120,fp160,p66,p51,gp41,p31,p24和17 kDa等抗原相应的抗体。我国对于WB实验结果判断标准：HIV阳性：至少有2条env带和至少1条env带和p24带同时出现。HIV阴性：无任何HIV抗体特异带出现。HIV可疑：出现HIV抗体特异带，但带型不足以确认阳性者。WB实验操作较ELISA稍复杂，检测需在确证实验室进行。由于自身抗体的存在，该方法仍有假阳性。

2．1．2．2 条带免疫印实验(LTA)其原理和操作方法与WB实验基本相同，只有条膜来源和组成有所区别。检测时信噪比高，本地清晰，无潜在假阳性干扰，克服了WB实验中使用病毒裂解产物而可能产生的同相载体上某些重要抗原不足缺点。这类试剂特异性高，但也有可能由于病毒株所合成抗原决定簇部位发生突变致HIV抗体假阴性。唯一缺点是由于合成抗原不能糖基化，其立体构象与天然抗原有一定差异，在一定程度上可能影响了模拟真实HIV抗原检测抗体的能力。

2．1．2．3 放射免疫沉淀实验本法是将感染的H9细胞和35S蛋氨酸孵育，用去垢剂将细胞溶解，再用抗LgGA蛋白琼脂糖去除有反应性的人抗原，将上清液(含有病毒蛋白)与待测血清混合，如有HIV抗体，则同位素标记的HIV蛋白与之结合产生沉淀。沉淀物用含有Cleland试剂的缓冲液和十二烷基硫酸(SDS)洗脱，即可将病毒抗原分离。然后病毒蛋白用放射自显影鉴定，并同时用已知的分子标记物比较。该方法敏感性和特异性比WB方法还高，但费时多，技术难度大。

2．2 抗原检测

HIV p24抗原的检测，用于抗逆转录病毒治疗医药疗效及HIV感染者发展为艾滋病的动态观察。

应用免疫荧光法、ELISA法及放射免疫直接测HIV抗原，通常测p24抗原，由p24抗原出现于抗体出现之前，对窗口期感染的早期诊断有帮助意义。为不断提高p24抗原的检出率，p24抗原检测技术近年有较大进展[14]。新的检测技术方法有：

2．2．1 免疫复合物裂解检测法(ICD),P24-ICD的敏感性为90%[7]，鉴于其敏感性较低，不宜单独使用。但在不具备先进仪器的地方有较大应用价值，为节省经费可在急性感染检测时替代HIV RNA检测。

2．2．2 超敏感酶免疫测定法(UEI)又称双位点免疫复合物转移酶免疫测定，基本技术路线是利用高亲和力抗体浓缩富集血清中的p24抗原，然后进检测。该法可将下限延伸至0．2 pg/ml,缺点是对试剂要求高，需要一定仪器，操作复杂。

2．2．3 免疫吸附电子显微镜法(ISEM)，将抗原特异性与电子显微镜的高分辨力相结合，实现了对病毒颗粒的直接特异性检测，灵敏度高。但需要昂贵精密仪器，操作复杂。

2．2．4 线性免疫酶测定(LIA)和Cobas Core HIV Combi EIA是新近发展起来的第四代HIV检测技术[3]。目前最敏感的抗原试剂盒的检测阈值为0．01 pg/ml。

2．3 HIV抗体检测的窗口期

从受艾滋病病毒感染到血液中可以测出艾滋病病毒的抗体，这段时间称为窗口期。由于人体免疫应答的差异，窗口期短的2~3周，长的2~3个月，一般45 d左右。处于窗口期的艾滋病病毒感染者血液中虽然检测不到抗体，但血液、、阴道分泌物等体液中含有艾滋病病毒而有传染性。

3 分子生物学核酸检测

3．1 原位杂交(insite hyrization)指应用特定的标记探针以分子杂交法直接检测标本中的HIV病毒靶核酸，最初为放射性标记，后来逐渐发展为酶标记或化学发光试剂标记。阳性率较PCR稍低，随着核酸扩增技术的出现，基因探针技术也失去了其应用价值。

3．2 聚合酶链反应(PCR)技术的一种以核酸生物学为基础的分子生物学诊断技术自1985年问世来，已成为生物医学领域最有价值的研究手段之一[8]。运用PCR技术对于阐明HIV的发病机制有极大价值，特别适用于新生儿感染的诊断。目前有两种方法用于HIV感染的检查：

3．2．1 PCR-DNA用于扩增前病毒DNA以诊断HIV感染。

3．2．2 PCR-RNA 用逆转录PCR(PT-PCR)法可检测出血浆中HIV基因组的存在。

3．3 定量PCR检测病毒载量 HIV病毒载量指体内病毒复制的数量,一般以血浆HIV RNA 的拷贝数表示；病毒载量定量检测具有十分重要的临床意义，Tetali等通过测定HIV RNA的浓度发现血浆中病毒载量度与疾病进展和存活率通过bDNA和流式细胞仪进行检测，发现血浆中病载量与CD4 T淋巴细胞存在明显关系，呈负相关趋势，完全可作为HIV感染者观察疾病病变的有效指标，尤其是HIV病毒载量更具敏感性[10]。目前主要有4种病毒载量定量PCR方法：bDNA、RT-PCR、NASBA及实时荧光定量PCR检测技术。

3．3．1 bDNA是一种核酸检测技术。它属于信号扩增，而RT-PCR及NASBA检测属于靶扩增。bDNA检测中靶探针是与HIV基因组中的pol基因序列特异结合，此段序所有已知的HIV基因组中最保守的区域。RT-PCR检测是通过逆转录(RT)及扩增(PCR)完成特异扩增HIVgag基因的一点长为142 bp的基因序列。由于每个样本中QS的量已知，运用公式算出HIV-RNA拷贝数从而达到HIV-RNA定量。NASBA检测是通过核酸释放提取(固有提取)、核酸扩增(NASBA扩增)及核酸检测(ECL)检测来完成对血浆血清中HIV病毒RNA的定量。PT-PCA,NASBA属于PCA方法，其中包括抽提RNA的步骤，所以比较受污染而使RNA降解的bDNA RT-PCR,N ASBA有较好的稳定性、线性和可重复性。薛以乐等通过实验比较bDNA与NASBA两处方法发现在检测HIV病毒载量时具有高度一致性能，NASBA法HIRNA低浓度时敏感更高，bDNA法则能测得更广泛的亚型标本[4]。

3．3．2 实时荧光定量PCR检测技术 其原理是 使用荧光基团标记探针，5＇端标记荧光基团，3＇端标记淬灭基团，在没有PCR扩增时，由于荧光基团和淬灭基团空间距离很近，使荧光基团被淬灭，不发荧光;而当PCR扩增时，引物与荧光标记的特异性探针同时结合在模板上，荧光标记的探针与模板结合的位置位于上下游引物之间，利用Taq酶的5＇-3＇外切酶活性，将荧光探针水解，荧光基团被释放出来，由于在空间上与淬灭基团的分开，则发出荧光。发出的荧光可以被荧光探头检测到，一边扩增，一边检测，这样就实现了“实时”检测。上述荧光探针，称为TaqMan探针[13]。荧光实时PCR检测技术的应用，改变了传统的电泳终点检测，可以进行实时监控，得到非常漂亮的S型扩增曲线。不但可以进行定性检测，更重要的是可以进行定量检测。样品中待测的DNA或RNA越高，则S型扩增曲线出现的越早，若有已知拷贝数的标准品，则可以得到未知样品的拷贝数。

3．4 基因芯片应用于HIV检测得到迅速发展人类免疫缺陷病毒(HIV) PRT440也广泛用于HIV-1病毒的测序、分型及多态性分析[1]。但由于该技术较为复杂，且成本高，目前对其应用仍大多停留在实验阶段，离临床检验及疾病诊断的普及性还有一段距离。

4 病毒分离培养

取新鲜分离的正常人淋巴细胞，用PHA刺激并培养3~4 d，接种患者单个核细胞、骨髓细胞、血浆或脑脊液等标本进行培养。培养过程中需定期换液和补加经PHA处理的新鲜正常人淋巴细胞。培养2~4周后，如有病毒生长，则出现不同程度的细胞病变。最明显是出现融合的多核巨细胞。细胞病变出现后，可用间接免疫荧光法检测培养细胞中病毒抗原，或用生化方法检测培养液中的逆转录酶活性，以确定HIV存在[6]。

5 CD4 T胞计数

目前最常用的方法是仪器法(流式细胞仪检测)。HIV感染人体后的主要靶细胞是CD4淋巴细胞(也累及其他细胞)。一般认为在疾病早期CD4淋巴细胞>0．5×109/L，中期为(0．2~0．5)×109/L，晚期则为(0．05~0．2)×109/L，而终期可为

综上所述，各种实验方法可以根据HIV感染的不同时期与状态选择不同的检测手段。HIV原发感染2周内，任何方法均无法检测到病毒，2周后出现病毒血症时，可检测病毒抗原，感染6~8周后可以选择检测抗体的方法。运用PCR技术可用来追踪HIV的自然感染史；可用来监测长期潜伏期(4~7年)患者；以及在抗病毒治疗期间的病毒载量水平；也可用于HIV-I血清阳性母亲的婴儿的HIV检测。在婴儿出生后最初6~9个月，他们的血清中存在母体的抗体，因此用PCR可判定婴儿是否真正被HIV感染。就目前而言，标准的检测方法是血清学HIV抗体检测，它是诊断艾滋病感染者和艾滋病的主要指标和标准检测项目；分子生物芯片等更新检测技术可能会广泛应用于临床HIV检测，会有更多的新技术被应用到这一领域。HIV的实验室检测正朝着敏感、准确、快速、自动化方向发展，我们可以用更灵敏、准确、快速的方法对HIV感染作出诊断。

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