PPARγ激动剂对成人正常皮肤成纤维细胞转分化的作用

[摘要]目的:观察过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)激动剂对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导成纤维细胞转分化的影响,探讨其抗瘢痕纤维化的潜在作用。方法:体外培养成人正常皮肤成纤维细胞,利用免疫荧光细胞化学法观察、分析PPARγ配体15-脱氧前列腺素J2(15d-PGJ2)及其激动剂曲格列酮对TGF-β1诱导的α平滑肌动蛋白(α-SMA)表达的影响,利用Western blot、实时荧光RT-PCR技术检测PPARγ激动剂对TGF-β1诱导的α-SMA蛋白及mRNA水平的影响。结果:TGF-β1能显著增加成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞;与TGF-β1诱导组相比,10μM 曲格列酮、15d-PGJ2预处理组的α-SMA表达量显著减少(P

[关键词]过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ);转化生长因子β1(TGF-β1);成纤维细胞;肌动蛋白

[中图分类号]R619+.6Q813.1[文献标识码]A [文章编号]1008-6455(2010)07-1006-03

Effects of PPARγ agonists on TGF-β1-induced transdifferentiation in normal skin

fibroblasts in vitro

YANG Chong-zhi,ZHANG Hui-tang,WANG Gong-sheng,ZHOU Hai-quan,MA Chi,HU Da-hai

(Department of Burn Surgery, PLA322 Hospital,Datong037006,Shanxi,China)

Abstract: ObjectiveTo observe the effects of peroxisome prolilerator-activated receptor γ (PPARγ) agonists on TGF-β1-induced transdifferentiation of the cultured the normal skin fibroblasts in vitro,so as to explore its effects on inhibiting the formation of hypertrophic scars.MethodsIn cultured normal skin fibroblasts,the effects of both natural (15d-PGJ2) and synthetic (troglitazone) PPARγ agonists on the level of TGF-β1-indued α-smooth muscle actin expression were assessed by immunofluorescence and image analysis.The effects of PPARγ agonists on the level of α-smooth muscle actin expression induced by TGF-β1 were detected by Western blot.ResultsIn normal skin fibroblasts,TGF-β1 enhanced transdifferentiation of fibroblasts to myofibroblasts .The level of α-SMA expression in 15d-PGJ2 and troglitazone-pretreated groupsrespectively were significantly decreased compared with TGF-β1-stimulated group (P

Key words: peroxisome prolilerator-activated receptor γ(PPARγ);ttransforming growth factor-β1;fibroblasts;actins

在增生性瘢痕中存在着大量以α-SMA为细胞标志物的肌成纤维细胞,它在超微结构上兼有成纤维细胞和平滑肌细胞的特征[1]。TGF-β1作为致瘢痕的主要生长因子,可使成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞。TGF-β1在增生性瘢痕中的持续存在及过量表达可增加α-SMA的生成,从而加重瘢痕的增生和挛缩。最近研究表明,临床上用于治疗糖尿病的胰岛素增敏剂PPARγ激动剂具有拮抗TGF-β1的上述效应[2-4]。本实验以正常皮肤成纤维细胞为研究对象,探讨PPARγ激动剂干预对TGF-β1诱导成纤维细胞α-SMA效应的影响,从而揭示PPARγ拮抗TGF-β1促瘢痕纤维化、挛缩的作用。

1材料和方法

1.1 主要试剂及仪器:人类重组TGF-β1(Peprotech公司,美国),15d-PGJ2、曲格列酮(Biomol公司,美国),鼠抗人α-SMA单克隆抗体、辣根过氧化物酶-山羊抗小鼠IgG (Santa Cruz,美国),兔抗鼠cy3-IgG(Sigma公司,美国),IX71型倒置式显微镜(Olympus,日本),TRIzol试剂(Invitrogen公司,美国),反转录反应试剂盒、SYBR Green 荧光定量试剂盒(TaKaRa生物工程公司,日本),DU800型分光光度计(Beckman Coulter,美国),Real-Time PCR仪(Bio- Rad公司,美国)。

1.2成纤维细胞培养:取整形手术中切下的多余正常皮肤组织(经患者知情同意),在无菌条件下漂洗、消毒。原代培养参照文献[5]组织块法进行,实验选用第3～6代细胞。

1.3 方法

1.3.1 实验分组:对照组加无血清DMEM培养基,干预组培养基依次为10ng/ml TGF-β1、10μM曲格列酮+10ng/ml TGF-β1、10μM15d-PGJ2+10ng/ml TGF-β1(药物干预组为两种药物分别预处理2h,再加入10ng/ml TGF-β1处理48h)。

1.3.2 免疫荧光细胞化学法观察α-SMA表达:在6孔培养板内制作细胞爬片,按实验分组加入培养基进行干预。培养48h后取出细胞爬片,以cy3行免疫荧光染色,以DAPI复染核,其中鼠抗人α-SMA抗体稀释度为1:200。荧光显微镜下观察,应用美国Media Cybnetics公司的Image-Pro Plus 6.0专业图像分析软件对爬片进行图像分析。

1.3.3 Western blot检测α-SMA蛋白表达:将各组细胞裂解液以BCA法进行蛋白定量,取40μg总蛋白以SDS-PAGE分离,半干法电转移至PVDF膜上,5%脱脂奶粉封闭,以鼠抗人α-SMA单克隆抗体(稀释比例1:500)作为一抗,4℃孵育过夜。辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(稀释比例1:4000)作为二抗,室温孵育2h,增强化学发光法显影。显影底片经Quantity One图像分析软件进行定量分析,以内参β-actin的吸光度(A)值为对照,其余电泳条带的A值与之相比所得比值表示结果。

1.3.4 实时荧光RT-PCR检测α-SMA mRNA水平:细胞总RNA提取及mRNA反转录参照试剂说明书进行。α-SMA上游引物:5′CAATGTCCCTGCCATGTACGTC 3',下游引物:5′GGCAGGGCATAG-CCTTCATAGA 3′。反应体系20 μl,含cDNA 5 ng,10 μl SYBR Green混合液,5 μmol/L 的引物1μl。采用Bio-Rad 的IQ5 系统进行SYBR Green 荧光定量PCR 分析,结果采用IQ5 软件行CT 值相对定量分析,以GAPDH 为内参,每个样品基因重复3管。

1.4 统计学方法:采用SPSS11.0统计软件包进行统计学处理,实验数据以 x±s表示,采用完全随机设计资料的方差分析行LSD-t检验。

2结果

2.1PPARγ激动剂对TGF-β1诱导的肌成纤维细胞转分化的影响:免疫荧光染色结果显示,α-SMA阳性表达为红色荧光,DAPI复染后细胞核呈蓝色荧光(图1)。以图像分析技术获得对照组、TGF-β1诱导组、10μM曲格列酮、15d-PGJ2预处理组的光密度平均值分别为0.101±0.011、0.878±0.029、0.303±0.024、0.195±0.034,统计学分析表明,TGF-β1诱导组的α-SMA阳性表达高于对照组(P

2.2 PPARγ激动剂对TGF-β1诱导的α-SMA蛋白表达影响:与空白对照组相比,TGF-β1显著增加α-SMA表达(P

2.3PPARγ激动剂对TGF-β1诱导的α-SMA mRNA水平影响:与对照组相比,TGF-β1诱导组显著增加α-SMA mRNA水平(P

3讨论

研究表明[6-7],在增生性瘢痕中存在着大量以α-SMA为细胞标志物的肌成纤维细胞,肌成纤维细胞比普通的成纤维细胞具有更强的增殖和分泌胶原的能力,并具有收缩性,其在时间与空间上的分布可影响伤口的收缩、瘢痕的形成。TGF-β1作为致瘢痕的主要生长因子,在增生性瘢痕中的持续存在及过量表达可增加α-SMA的生成,从而加重瘢痕的增生和挛缩。本实验进一步验证此结论,经免疫荧光细胞化学法及Western blot检测显示,TGF-β1诱导成纤维细胞后,α-SMA表达量均比空白对照组明显增多(P

PPARγ是一类配体激活的核转录因子超家族成员,脂肪酸、花生酸类物质和部分前列腺素如15d-PGJ2(15-deoxy-Δ12,14-prostaglandin J2)是其天然配体,胰岛素增敏剂噻唑烷二酮类药是其人工合成配体[9]。目前,PPARγ在抗器官纤维化方面的有效作用成为新的研究热点。此类研究集中于抗内脏器官的纤维化,尤以抑制肾小球硬化、肝硬化及肺纤维化研究较多[10-12],但有关PPARγ激动剂抗皮肤瘢痕化的研究还未见相关文献报道。本实验Western blot检测发现,正常皮肤成纤维细胞经10ng/ml TGF-β1诱导后α-SMA表达明显升高(P

综上所述,本实验结果显示,PPARγ激动剂可有力拮抗TGF-β1诱导成人正常皮肤成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞。提示PPARγ激动剂在抗皮肤病理性瘢痕方面具有潜在的应用前景,可能会成为临床上防治病理性瘢痕的新途径。

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[收稿日期]2010-04-06 [修回日期]2010-06-18