白藜芦醇对模拟日光照射后黑素和朗格汉斯细胞的影响

[摘要]目的:观察白藜芦醇对模拟日光照射后黑素和朗格汉斯细胞的影响。材料和方法:招募11名健康女性志愿者,在每位志愿者背部选取6个非曝光部位。部位1～4分别涂抹白藜芦醇+抗氧化剂、抗氧化剂、白藜芦醇、基质,30min后予1.5倍最小红斑量的模拟日光照射,部位5仅予照射而不涂抹检测物质(阳性对照),部位6既不照射亦不涂抹检测物质(阴性对照)。每天照射一次,连续照射4天。末次照射后24h对皮肤进行取材,进行Fontana Manna 染色及CD1a免疫组化染色。结果:阳性对照部位和涂抹基质部位黑素含量指数 (melanin content index,MCI) -目标面积/场面积比值(%)及平均光密度值显著上升,朗格汉斯细胞显著减少;而双侧涂抹白藜芦醇+抗氧化剂、抗氧化剂、白藜芦醇的部位MCI-目标面积/场面积比值(%)及平均光密度值轻度上升,朗格汉斯细胞轻度减少,与阳性对照部位和涂抹基质的部位相比具有显著差异(P

[关键词]白藜芦醇;模拟日光照射;黑素;朗格汉斯细胞

[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455(2010)07-0999-04

Protective effects of resveratrol on melanin and Langerhans cells from solar simulator ultraviolet irradiation

JIA Li-li,LI Yuan-hong,WU Yan,ZHENG Ying-na,JIANG Li-li

(Department of Dermatology,No 1 Hospital of China Medical University,Key Laboratory of Immunodermatology,Ministry of Health (China Medical University) Shenyang 110001,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of resveratrol on melanin and Langerhans cells from solar simulator ultraviolet irradiation (ssUVR). Materials and MethodsEleven healthy female volunteers were enrolled in this study. Six sites on the non-exposed back skin were marked for the experiment. Sites 1～4 were applied with resveratrol (Res)+antioxidant (Aox), antioxidant, resveratrol, vehicle, and followed by ssUVR at a dosage of 1.5 minimal erythema dose (MED) 30 min later. Site 5 received ssUVR without any test material(positive control)and site 6 received neither ssUVR nor test materials (negative control). The skin biopsies were taken 24 hours after the last ssUVR. The specimens were stained with Fontana Manna staining and immunohistochemistry staining of Monoclonal Antibody-CD1a. Results The measured percentage(%) and average optical density of MCI increased significantly on UV only site and Vehicle+UV site,much higher than on Res+Aox+UV site, Aox+UV site and Res+UV site (P

Key words:resveratrol;solar simulator ultraviolet irradiation; melanin; Langerhans cell

过多地接触紫外线辐射可引起皮肤晒伤、晒黑、皮肤光敏反应、皮肤光老化甚至皮肤癌等,此外还可引起光性角膜炎,增加发生皮质性白内障、翼状胬肉甚至眼黑色素瘤的危险性[1]。白藜芦醇(resveratrol, Res)是植物界分布较广的羟基二苯乙烯类化合物,主要存在于葡萄、虎杖、花生、桑椹、松树等21个科,31个属的72 种植物中,其中在新鲜葡萄皮中的含量最高[2]。研究发现白藜芦醇具有多种药理活性,如抗肿瘤[3], 抗炎[4]、抗菌、抗氧化、抗自由基、肝脏保护、神经保护、心血管保护、免疫调节、植物雌激素作用等。本研究旨在观察白藜芦醇是否对模拟日光照射(solar simulator ultraviolet irradiation, ssUVR)诱导的黑素增加及朗格汉斯细胞(Langerhans cell, LC)减少具有防护作用。

1材料和方法

1.1 志愿者:招募11名健康女性志愿者,每位志愿者均签署了知情同意书。年龄45～58岁。入选标准:无系统性疾病或皮肤病;未接受系统性治疗及皮肤局部治疗;无光敏史;非妊娠或哺乳妇女。试验于2009年1～2月(北方冬季)进行,以尽量减少外界环境中紫外线的影响[5]。

1.2试验材料:①白藜芦醇+抗氧化剂、抗氧化剂、白藜芦醇、基质均由雅诗兰黛公司(美国纽约)提供。基质霜为保湿霜,不含防晒剂,SPF值

1.3 实验仪器:日光模拟器(GS2006 3.0E版,中国计量科学研究院,北京),包括一个450W的氙灯加上一个WG320 滤光片(Schott,Clichy,France),光线输出模拟连续的290 nm 至400nm 的日光紫外线输出,可发射出15倍太阳光强度的模拟日光。

1.4 实验方法:①试验开始前测定每位志愿者MED;②在志愿者背部6个部位进行如下操作:部位1～4分别涂抹白藜芦醇+抗氧化剂、抗氧化剂、白藜芦醇、基质30min后予1.5倍MED的ssUVR,部位5仅予照射而不涂抹检测物质(阳性对照),部位6既不照射亦不涂抹检测物质(阴性对照)。详见表1。各照光部位每日照射1次,连续照射4天。末次照射后24h对受试部位皮肤取材,用10%甲醛固定后行石蜡切片,进行Fontana Manna 染色及CD1a免疫组化染色。

1.5染色方法

1.5.1Fontana Manna染色:①切片常规用二甲苯脱蜡,经各浓度乙醇至水洗;②蒸馏水清洗5min×2次;③将切片置于GRAM液中10min;④用蒸馏水彻底清洗1h;⑤将切片置于FONTANA染液中,避光放置24h。蒸馏水清洗5min×2次;⑥在切片上滴加0.1%氯化金30μl,4min,蒸馏水清洗5min×2次;⑦5%硫代硫酸钠固定2min,蒸馏水清洗5min×2次;⑧ 过滤好的KERNECHTROT染液,染色5min;⑨乙醇、二甲苯脱水、透明。中性树胶封片,镜下观察。

1.5.2CD1a免疫组化染色(S-P法):①切片常规用二甲苯脱蜡和梯度酒精脱水;②置于pH6.0的柠檬酸盐缓冲液中,121。C蒸汽高压消毒箱内抗原热修复10min;③自然冷却后,3%H2O2去离子水孵育5～10min。PBS冲洗,2min×3次;④滴加一抗,4℃冰箱过夜。PBS冲洗,2min×3次;⑤滴加山羊抗小鼠IgG抗体-HRP多聚体,37℃孵育30min;PBS冲洗,2min×3次;⑥显微镜下控制DAB显色,大约5～20min。蒸馏水冲洗;⑦苏木素复染;⑧乙醇、二甲苯脱水、透明,中性树胶封片。

1.6结果判断标准:①MCI:使用Image-Pro-Plus 6.0多媒体彩色病理图文分析系统,对Fontana Manna法染色切片进行MCI计数;每张切片连续选取10个非重叠视野,测定受检基底层和棘细胞层内黑素颗粒面积占该处表皮基底层和棘细胞层总面积的百分比及平均光密度值;②朗格汉斯细胞:于400倍光镜下,每张切片连续选取10个非重叠视野计数朗格汉斯细胞总数。

1.7统计学分析:采用16.0版SPSS软件包进行统计学分析。各组间数据比较采用方差分析。P

2结果

2.1黑素:经过1.5倍MED的模拟日光连续照射4次后,各照光部位MCI-目标面积/场面积比值(%)及平均光密度值不同程度降低,其中阳性对照部位(部位5)和涂抹基质部位(部位4)MCI-目标面积/场面积比值(%)及平均光密度值显著下降,而涂抹白藜芦醇+抗氧化剂(部位1)、抗氧化剂(部位2)、白藜芦醇(部位3)的部位MCI-目标面积/场面积比值(%)及平均光密度值轻度下降,与阳性对照部位和涂抹基质的部位相比具有显著差异。见图1～3。

2.2朗格汉斯细胞:经过1.5倍MED的模拟日光连续照射4次后,各照光部位朗格汉斯细胞不同程度地减少,其中阳性对照部位(部位5)和涂抹基质的部位(部位4)朗格汉斯细胞显著减少,而涂抹白藜芦醇+抗氧化剂(部位1)、抗氧化剂(部位2)、白藜芦醇(部位3)的部位朗格汉斯细胞轻度减少,与阳性对照部位和涂抹基质的部位相比具有显著差异。详见图4和图5。

3讨论

有文献报道紫外线照射是导致皮肤色素沉着的最强的刺激因素之一[7]。紫外线照射后表皮基底层黑素细胞中的酪氨酸氧化酶活性增加,促使新的黑色素合成,黑素在黑素细胞体内合成后以黑素小体的形式传递到周围的角质形成细胞并在角质形成细胞内重新分布和降解,从而起到调节皮肤颜色、抑制紫外线辐射的作用,此过程被称为黑素传递。黑素传递过程通过调节角质形成细胞中传递的黑素小体的大小、数量和分布从而影响着人的皮肤颜色[8]。既往研究表明白藜芦醇很可能是蛋白质底物的一种竞争性抑制剂,无论顺式还是反式结构都具有明显的酪氨酸蛋白激酶抑制活性[9],从而抑制黑素合成,阻止皮肤变黑。本研究发现,经过1.5倍最小红斑量的模拟日光连续照射4次后,各照光部位黑素不同程度增加,其中阳性对照部位和仅涂抹基质部位增加最为显著,而涂抹白藜芦醇联合抗氧化剂和仅单独涂抹白藜芦醇或抗氧化剂的部位相对增加较少,提示联合外用白藜芦醇和抗氧化剂或单独外用二者之一均能有效地防护模拟日光照射诱导的黑素增加。

朗格汉斯细胞是表皮内的抗原递呈细胞,在皮肤免疫反应中起着关键作用。大量研究证实紫外线照射可导致表皮内免疫递呈细胞- 朗格汉斯细胞减少或衰竭,从而导致免疫抑制甚至皮肤癌的发生[10]。本研究发现,经1.5倍最小红斑量的模拟日光连续照射4次后,各照光部位朗格汉斯细胞数量明显减少,这与以往研究结果相符[11],其中阳性对照部位和仅涂抹基质部位减少最为显著,而涂抹白藜芦醇联合抗氧化剂和仅单独涂抹白藜芦醇或抗氧化剂的部位减少相对较少,提示联合外用白藜芦醇和抗氧化剂或单独外用二者之一均能有效地防护模拟日光照射诱导的朗格汉斯细胞减少。

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[9]Fitzpatrick TB. The validity and practicality of sun-reactive skin types Ⅰ through Ⅵ[J]. Arch Dermatol, 1988, 124:869-871.

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[收稿日期]2010-04-22 [修回日期]2010-06-30