新型生物交联剂京尼平的性质与应用

一、京尼平简介

交联剂已经被广泛地应用于细胞膜结构、蛋白质结构、蛋白质间相互作用、生物导弹、载体蛋白与半抗原的连接、蛋白质或其他分子的固相化及抗体的标记等生物领域的研究。常用的交联剂有戊二醛、双重氮联苯胺2,2′二磺酸、1,5二氟2,4二硝基苯与己二酰亚胺酸二甲酯等。但这些化学交联剂在使用中存在毒性高，污染严重等缺点。因此，寻求一种低毒性、生物可降解的交联剂来代替戊二醛已非常必要。

京尼平（Genipin）是栀子苷经β-葡萄糖苷酶水解后的产物，是一种优良的天然生物交联剂。一般采用从栀子中提取京尼平苷，再用β-葡萄糖苷酶水解，然后用乙醚萃取、真空浓缩、重结晶而制得，也可以采用微生物转化法制备[1、2]。栀子属于茜草科植物，是我国盛产的一种中药材，具有利胆、保肝等功效，在我国应用于临床治疗已有1600多年历史[3]。栀子果实的化学成分很多，主要包括藏红花素类、栀子苷类和多元酚类，其中栀子苷的主要成分为京尼平苷[4]。京尼平苷是一种环烯醚萜葡萄糖苷，无毒、易溶于水，京尼平苷在杜仲和栀子中含量均较高，达到3%~8%左右。

Djerassi等[5]早在1960年就利用核磁共振光谱数据和化学降解实验发现了京尼平，其分子式为C11H14O5，属于环烯醚萜类物质，京尼平苷与京尼平的结构式可见图1.2。京尼平本身是无色的，但是它与氨基酸发生反应后，会产生蓝色化合物，这种蓝色化合物是可以食用的，现在已被用在食品着色剂中[6]。

二、京尼平交联机理

随着京尼平参与明胶、壳聚糖等交联反应的广泛化，其交联反应机理也先后被报道[1,7-9]。图1.3为含氨基聚合物与京尼平交联反应的示意图[9]。京尼平交联明胶、壳聚糖等含氨基基团的化合物的机理最为成熟的是pH依赖型机理[2]。在不同的pH条件下，京尼平与壳聚糖等的交联机理不同。

1.在酸性和中性条件下，壳聚糖上的氨基基团亲和攻击京尼平C-3位的烯碳原子，二氢吡喃环打开，形成杂环胺，这样可以形成由短链京尼平为交联桥的网状结构聚合物。这种通过壳聚糖的氨基集团对京尼平上的酯基进行亲核取代的反应，在酸催化的条件下才能发生。

2.在碱性条件下，水溶液中的OH亲核攻击京尼平，京尼平开环形成一个醛基中间体，开环京尼平单分子醛醇缩合形成大分子聚合物。聚合京尼平的末端醛基可以和壳聚糖上的氨基进行Schiff碱反应，形成交联网状结构。这说明京尼平分子可以先进行聚合，以形成长链京尼平交联桥的网状结构聚合物。因此，环境的pH条件对京尼平交联明胶、壳聚糖等胶体制备中的交联反应有很大影响。交联键的性能和长度取决于交联反应的pH。在酸性条件下，通过壳聚糖产生的京尼平C-3中碳的亲核攻击由于氨基的质子化而受到抑制。与之相反，酸催化改善了京尼平酯基的亲核取代反应，形成了带有壳聚糖的二次酰胺。京尼平交联明胶、壳聚糖等形成的网络结构在这种情况下是由交联短链制备而成的。相反，随着碱性的增强，京尼平将更容易在交联明胶、壳聚糖等之前，先进行自身聚合反应。因此，在强碱条件下，京尼平交联明胶、壳聚糖等形成的网络结构是由交联长链组成的[2]。

三、京尼平的应用

京尼平是一种低毒性、生物可降解的天然化合物，近年来，作为交联剂在生物及医学领域得到了广泛应用。京尼平除了是一种中医药材之外[4,10]，还可以与蛋白质、胶原、明胶和壳聚糖等交联制作生物材料，如人造骨骼、伤口包扎材料等，其毒性远低于戊二醛和其他常用化学交联剂。京尼平也可用做指纹采集试剂和制备固定化酶的交联剂。

1.京尼平在医学领域的应用

京尼平作为一种新型生物交联剂，形成的交联制品稳定性强、细胞毒性小、生物相容性好、不发生降解与钙化等。京尼平在药物控释材料方面的应用近年来有大量的研究报道[10-11]，这些研究都表明，京尼平作为一种天然生物交联剂，其交联反应温和，交联度可控，成为植入式药物缓释系统的良好载体，对蛋白类药物的控释缓释具有显著的优势。京尼平也已成功应用于人造生物敷料、异体组织、人工血管、组织工程血管、人工骨和骨缺损修复等[12-14]。

2.京尼平应用于食用色素和生物检测显色剂

目前在食品工业越来越要求使用天然食用色素，但在众多的天然色素中，作为三原色的红、黄、蓝，蓝色素品种较少，稳定性较差，因而研究天然蓝色素成为急需解决的一项课题。将京尼平与氨基酸反应，可制得的一种安全无毒的食用天然色素，它耐热、耐光、耐酸碱，pH适应范围广，易溶解于水和低醇，可替代化学合成蓝色素单独使用，也可以与红、黄类色素调配成绿、紫、棕等色调混合使用，在国外被广泛用于食品、药品及化妆品等产品的着色[69]。京尼平除了用于食用色素外，还可以用作显色剂测定氨基酸的含量。Lee等[15]利用从栀子中提取的京尼平苷水解的京尼平，建立了一种新的氨基酸的测定方法。京尼平与氨基酸反应呈蓝色，与水合茚三酮显色系统相比，摩尔吸光系数最大可增大14倍，灵敏度更高，且系统受杂质影响较小，低浓度的金属离子Cu2+和Fe3+对吸光度基本无影响。

3.京尼平作为固定化酶交联剂

京尼平作为一种天然生物交联剂，在固定化酶中的应用也有相关报道。Fujikawa等[16]用京尼平交联细胞色素C，凝胶电泳结果显示，京尼平可以使细胞色素C分子之间交联，形成细胞色素C齐聚体。他们还采用海藻酸钙凝胶固定β-葡萄糖苷酶[17]，结果显示，使用京尼平比用其他交联剂所得的固定化酶酶活性高，重复使用12次后，酶活仍保持在100%。随后，京尼平也被应用在了糖化酶、蛋白酶和柚苷酶的固定化中，并申请了专利[18]。

参考文献：

[1]Mi F L, Shyu S S, Peng C K. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry, 2005, 43(10): 1985-2000.

[2]Tsai T R, Tseng T Y, Chen C F, et al. Journal of Chromatography A, 2002, 961(1): 83-88.

[3]付红蕾, 梁华正, 廖夫生. 时珍国医国药, 2005, 16(1): 54-56.

[4]Djerassi C, Gray J D, Kincl F A. The Journal of Organic Chemistry, 1960, 25(12): 2174-2177.

[5]Touyama R, Inoue K, Takeda Y, et al. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 1994, 42(8): 1571-1578.

[6]Bigi A, Cojazzi G, Panzavolta S, et al. Biomaterials, 2002, 23(24): 4827-4832.

[7]Sisson K, Zhang C, Farach-Carson M C, et al. Biomacromolecules, 2009, 10(7): 1675-1680.

[8]Butler M F, Ng Y F, Pudney P D A. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry, 2003, 41(24): 3941-3953.

[9]Song F, Zhang L M. Industrial and Engineering Chemistry Research, 2009, 48(15): 7077-7083.

[0]Song F, Zhang L M, Yang C, et al. International Journal of Pharmaceutics, 2009, 373(1-2): 41-47.

[11]Silva S S, Motta A, Rodrigues M T, et al. Biomacromolecules, 2008, 9(10): 2764-2774.

[12]Chen K Y, Liao W J, Kuo S M, et al. Biomacromolecules, 2009, 10(6): 1642-1649.

[13]Sung H W, Liang I L, Chen C N, et al. Journal of Biomedical Materials Research Part A, 2001, 55(4): 538-546.

[14]Lee S W, Lim J M, Bhoo S H, et al. Analytica Chimica Acta, 2003, 480(2): 267-274.

[15]Fujikawa S, Nakamura S, Koga K. Agricultural and Biological Chemistry, 1988, 52(3): 869-870.

[16]Fujikawa S, Yokota T, Koga K. Applied Microbiology and Biotechnology, 1988, 28(4): 440-441.

注：“本文中所涉及到的图表、公式、注解等请以PDF格式阅读”