绿色木霉复合木聚糖酶的固态发酵条件优化

摘要：目的研究不同发酵条件对绿色木霉产复合木聚糖酶性能的影响。方法采用固体发酵培养方式，通过改变发酵条件，包括碳源、氮源的种类、浓度及接种量，测定相应条件下发酵产物的酶活性来确定发酵工艺。结果绿色木霉产酶的最佳碳源为玉米芯和麸皮（4∶6）；氮源为硫酸铵（4％）；接种量为1×107个孢子/g培养基。30 ℃固体培养70 h，发酵后用无菌水（pH 5.0）28 ℃浸提3 h测定酶活性。结论在优化的培养条件下，木聚糖酶的最高酶活性达到 267 U/g。

关键词：绿色木霉；复合木聚糖酶；固体发酵

中图分类号：Q556+.2文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007)03-0005-03

Condition Optimization on Complex Xylanase by Trichoderma viride in Solid-state Fermentation

SU Yi-shan, ZHANG Xiao-yuan, ZHU Xi-qiang*, GUO Xue-ping, LING Pei-xue

(Institute of Biopharmaceuticals of Shandong Province, Jinan 250108, China)

Abstract：Objective To study the effects of fermentation conditions on the production of complex xylanase by Trichoderma viride. Methods An optimized incubation condition in solid-state fermentation was achieved by determining the enzyme activity when altering culture conditions, such as types and concentrations of carbon source, nitrogen source and inoculum volume. Results The optimized condition in solid-state fermentation ofTrichoderma viride was as follows：corncob and wheat bran（mass ratio 4:6） as carbon sources，4％ (NH4)2SO4 as nitrogen source, inoculum volume of 1×107 spores/g, incubation at 30 ℃ for 70h, respectively. The enzyme extraction obtained with sterile water at 28 ℃ for 3h was used for the activity determination. Conclusion Under the optimal condition, the activity of xylanase by Trichoderma viride reaches up to 267 U/g.

Key words：Trichoderma viride；complex xylanase; solid-state fermentation

复合木聚糖酶通常包括β-1,4-木聚糖酶（EC 3.2.1.8）和木糖苷酶（EC3.2.1.37）。前者又称内切木聚糖酶，它从主链内部作用于木糖苷键，将大分子木聚糖降解成低聚木糖、木二糖及少量的木糖，而后者作用于木寡糖或木二糖的末端，释放出木糖 [1-2]。用于低聚木糖生产，需尽可能获得内切木聚糖酶活性高、木糖苷酶活性低的复合木聚糖酶。该酶可以由细菌、放线菌和霉菌产生。近年研究表明，该酶在造纸工业中可部分替代含氯的化合物用于纸浆漂白，可改善纸浆性能，减少漂白工艺中化学物质的用量，大大减少环境污染[3]。复合木聚糖酶还可用作饲料添加剂，去除戊聚糖类的抗营养因子，提高饲料的利用率和能量值，可用于农业有机废弃物的深加工处理，生产高附加值的低聚木糖产品[4]。木聚糖酶作为工业酶制剂在我国尚未大规模利用。我们研究了绿色木霉木聚糖酶固体发酵的优化条件。

1材料

1.1菌种、试剂等

绿色木霉（中科院微生物所）；玉米芯，麸皮（济南当地工厂）；

桦木木聚糖、木糖、胰蛋白胨、酵母提取物均系Sigma产品；其他试剂为分析纯；Gel Plate F254薄层层析板（Merck Germany）。

1.2培养基

斜面培养基：PDA培养基，马铃薯200 g去皮切块，加1 000 mL蒸馏水，煮沸10～20 min。用纱布过滤，补加蒸馏水至1 000 mL。加入葡萄糖20 g和琼脂20 g，加热溶化，分装，121℃高压灭菌20 min。

发酵培养基：麸皮、玉米芯适量比例，加入一定量的供试氮源，按1∶10的比例添加mandels盐营养液。

2方法

2.1种子培养

将保存菌种接种于PDA平板培养基，30 ℃培养 72 h。

2.2发酵培养

用无菌水洗下绿色木霉斜面上的孢子，制成孢子悬液，显微镜下计数，按适当接种量接种于固体发酵培养基，30 ℃培养合适时间。

2.3木聚糖酶活性测定

在25 mL刻度试管中加入0.01 g/mL乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 5.0）配制的木聚糖溶液1.8 mL，55 ℃水浴保温5 min，加入适当稀释的酶液0.2 mL。55 ℃水浴保温10 min。加入DNS（3,5-二硝基水杨酸）试剂2 mL，沸水浴保温5 min，冷却后于5 50 nm处测吸光度值。每1 min产生相当于1μmol还原糖（以木糖计）的酶量定义为一个酶活性单位（U）。

2.4粗酶液制备

将发酵完成后的固体培养基用无菌水（重量比，玉米芯∶无菌水＝1∶10）浸泡抽滤得粗酶液，经适当稀释，以木聚糖为酶反应底物，测定酶活性。

2.5还原糖测定

采用DNS法[5]。

3结果

3.1玉米芯及麸皮对复合木聚糖酶酶活性的影响

玉米芯与麸皮均为绿色木霉发酵产生复合木聚糖酶的良好碳源，但是不同的碳源组合发酵产生复合木聚糖酶的酶活性不同，见表1。TLC显示复合木聚糖酶的酶解产物组成也不同，见图1。

表 1不同碳源组合对复合木聚糖酶酶活性的影响

图1不同麸皮与玉米芯比例的碳源组合对酶活性的影响

M：低聚木糖标准样品，从左至右麸皮含量逐渐降低

由综合分析可见，随着麸皮在碳源组成中比例的提高，总酶活性逐渐提高，但是木糖苷酶在复合酶中所占比例提高，水解木聚糖产物中木糖比例也逐渐提高。所以不同的碳源组成对复合木聚糖酶中两种酶的诱导程度不同，麸皮比例提高能提高木糖苷酶的酶活性。木寡糖中以二糖、三糖所占比例最大为优，复合木聚糖酶中两种酶的比例必须适中，才能使降解液中二糖、三糖所占的比例最大，所以最佳碳源组成为玉米芯∶麸皮＝4∶6。

3.2不同氮源对复合木聚糖酶活性的影响

为了确定复合木聚糖酶固体发酵的最优氮源，在固体发酵培养基中分别添加5%的不同氮源：尿素、硫酸铵、酵母粉、蛋白胨和硝酸钠。结果表明，以硫酸铵为氮源发酵复合木聚糖酶的酶活性最高，尿素次之，硝酸钠最低，结果见图2。

图 2不同氮源对复合木聚糖酶酶活性的影响

3.3氮源最适添加量的确定

以玉米芯粉+麸皮（4∶6）作培养基，分别添加培养基干料的1％，2％，3％，4％，5%的硫酸铵作氮源进行产酶试验，结果见表2。当硫酸铵添加量为培养基干料的4％时，复合木聚糖酶酶活性较高。

表 2不同含量氮源对复合木聚糖酶酶活性的影响

3.4不同接种量对复合木聚糖酶酶活性的影响

接种量主要影响菌体的生长，接种量太小菌体生长缓慢延长发酵时间，影响复合木聚糖酶的发酵；接种量太大菌体生长太快，产生的热量不利于后期产酶。由表3可见，当接种量控制在每1 g固体培养基接种1×107个孢子时，复合木聚糖酶酶活性最高。

表 3孢子接种量对绿色木霉发酵复合木聚糖酶酶活性的影响

3.5吐温-80对复合木聚糖酶酶活性的影响

表面活性剂能够影响细胞膜的通透性，从而影响复合木聚糖酶向细胞外的分泌，但是如果表面活性剂的浓度太大会影响细胞的生长。绿色木霉在吐温-80（即聚山梨酯80）浓度为0.3μL/g时分泌的复合木聚糖酶最多，酶活性最高，几乎是空白对照的2倍；浓度再提高时则影响菌体的生长，酶活性降低，结果见图3。

图 3吐温-80对复合木聚糖酶酶活性的影响

3.6绿色木霉固体发酵产酶曲线

绿色木酶在上述确定的最优条件下固体发酵，在发酵20，40，50，60，70，80，120 h时取样测定复合木聚糖酶活性，绘制产酶曲线，见图4。结果表明，随着反应时间的增长，复合木聚糖酶活性呈上升趋势，当发酵培养70 h左右，酶活性最大，然后随着时间的延长，酶活性略有降低。可能是由于反应时间延长，一方面产生热量致部分酶失活，另一方面，酶蛋白被菌体自溶产生的蛋白酶降解。

图 4 绿色木霉固体发酵产酶时间曲线

4讨论

不同的碳源对复合木聚糖酶系中各个组分的诱导作用是不同的，就绿色木霉的复合木聚糖酶固体发酵而言，碳源中麸皮含量提高能增加复合酶的总酶活性，但是，内切木聚糖酶的酶活性并没有升高，这对有些生产是不利的。所以最优碳源组成为玉米芯∶麸皮=4∶6，这对将绿色木霉复合木聚糖酶用于低聚木糖的生产有重要意义。

参考文献

[1]刘巍，范树田，李心治，等. 地衣芽孢杆菌H-1的鉴定及其产木聚糖酶性质的研究[J]. 工业微生物，1996，26（4）：11-15.

[2]曾宇成，张树政. 海枣曲霉木聚糖酶的提纯和性质[J]．微生物学报，1987，21（4）：343-349.

[3]Garg A P, Mocathy A J, Roberts J C．Biobhaehing effect of Streptomyces thermoviolaceus mase preparations on birchwood kraft pulp[J]．Enzyme Microbial Technol, 1996, 18: 261-267.

[4]赵林果，陈牧，余世袁. 不同性质的木聚糖底物定向酶解制备木低聚糖的研究[J]. 食品与发酵工业，2001，26（6）：1-5.

[5]Khan A W, Tremblay D, LeDuy A. Assay of xylanase and xylosidase activities in bacterial and fungal cultures[J]. Enzyme Microb Technol, 1986, 8(6): 373-377.