肝素黄杆菌肝素酶性质的研究

摘要：目的研究肝素酶I的理化性质。方法测定肝素酶I的相对分子质量、等电点、紫外吸收光谱、N端序列，以及各种环境因素对酶活性和酶稳定性的影响。结果相对分子质量约为43×103，等电点为8.5。N端序列不能测到。酶的最适催化条件为：温度45℃，pH 6.4~7.0，离子强度150 mmol/L。酶在35℃以上极易失活，在pH 7~11之间基本稳定。该酶的最大紫外吸收位于280 nm。H2O2（1 mmol/L, 10 mmol/L），NaN3（10 mmol/L, 100 mmol/L），乙腈（1％，10％），1 mol/L盐酸胍和1 mol/L尿素对酶的活性无影响；1％SDS，4 mol/L盐酸胍和4 mol/L尿素则使酶完全失活；CaCl2和MgCl2是该酶的激活剂，FeCl2则对该酶的活性具有抑制作用。结论通过实验，测定了肝素酶I的主要理化性质。

关键词：肝素黄杆菌；肝素酶I；理化性质

中图分类号：R977.3文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007)02-0014-04

Characterization of Flavobacteriun heparinum Heparinase I

MA Xiao-lai，YUAN Qin-sheng

（State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237，China）

Abstract：Objective To study physico-chemical properties of heparinase I. Methods Properties of the enzyme including relative molecular mass, isoelectric point, N-terminal amino acid sequence, optimal temperature and pH, UV absorbance, and the influence of the environment factors on activity and stability of the enzyme were determined. Results The enzyme had a relative molecular mas of 43×103 and the pI was about 8.5. The N-terminal amino acid sequence could not be determined. It had an activity maximum at pH6.4~7.0 and 41℃. The enzyme with a maximum UV absorbance at 280 nm was very sensitive to thermal denaturation at temperature up to 35 ℃. H2O2(1 mmol/L, 10 mmol/L), NaN3(10 mmol/L, 100 mmol/L), acetonitrile（1％, 10％）, 1mol/L carbamidine hydrochloride and 1mol/L urea had no influence on the activity of the enzyme. The enzyme was sensitive to 1％ SDS，4mol/L carbamidine hydrocloride and 4mol/L urea. CaCl2 and MgCl2 were two activators of the enzyme, while FeCl2 was an inhibitor. Conclusion The main physico-chemical properties of heparinase I are clear by experiments.

Key words：Flavobacteriun heparinum；heparinase I；physico-chemical characterization

肝素酶（heparinase）是指一类能够特异性地裂解肝素和类肝素主链糖苷键的酶，可以清除血液中的肝素，并常用于测定肝素的结构以及抗肿瘤等方面的研究[1-3]。肝素酶最初从肝素黄杆菌中发现并分离，后来发现其他一些微生物或动物组织中也存在[4]。近年，肝素酶用于低分子肝素生产和链上精确结构的研究很多。目前国际上约有3家公司售卖肝素酶，都是肝素黄杆菌肝素酶，价格昂贵。我们在肝素黄杆菌菌种保存、发酵生产、以及分离纯化方面做了大量工作。先后采用2种新的纯化工艺[5，6]分离得到电泳纯的肝素酶I，最高活性收率达到18%，高于其他报道。为了便于在科研和工业生产中应用此酶，我们对其性质作了详细的研究。

1材料

1.1样品

肝素酶，本室纯化至电泳纯，比活为90 U/(mgpro)。

1.2仪器

分光光度计（Unico公司）

1.3试剂

NaN3，乙腈，NaCI，CaCl2，MnCl2， BaCl2，ZnCl2，MgCl2，CoCl2，CuCl2， FeCl2，十二烷基硫酸钠（SDS），盐酸胍及尿素等均为国产分析纯。

2方法

2.1酶活性和蛋白质含量测定

酶活性测定采用A232法，测定30 ℃下酶液裂解肝素产生的双键的量，以1 min内产生1 μmol产物所需的酶为1个单位。蛋白质测定用Lowry法[7]。

2.2相对分子质量测定

采用不连续系统的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE），参照文献[8]，分离胶浓度为12%。采用的相对分子质量标准蛋白质分别为：兔磷酸化酶B（97.4×103），牛血清白蛋白（66.2×103），兔肌动蛋白（43.0×103），牛碳酸酐酶（31.0×103），胰蛋白酶抑制剂（20.1×103），鸡蛋清溶菌酶（14.4×103）。

2.3等电点的测定

在12%的聚丙烯酰胺凝胶上进行二维电泳，以2%的ampholytoid（类两性电解质）形成3~10 pH梯度。将纯化的蛋白质上样于水平放置的胶上，以梯度方式提高电压，100 V15 min，再200 V15 min，最后450 V 60 min。整个过程在2 ℃进行。等电聚焦完后，用考马斯亮蓝染色。根据目的蛋白质的斑点估算等电点。

2.4紫外吸收光谱的测定

利用紫外分光光度计在紫外光区（200~300 nm）进行扫描，测定最大吸收峰处的波长。

2.5N端测定

取100 μg纯化的酶，上样于12%的SDS-PAGE凝胶，共7个泳道，每泳道上样量为14μg。电泳结束后，胶上的蛋白质被转至PVDF膜，洗下膜上的蛋白质，用氨基酸序列分析仪测定。测定过程由中科院上海生命科学研究院完成。

2.6环境因素对酶活性的影响

2.6.1温度对酶活性的影响酶活性测定体系为1 mg/mL肝素溶液，用pH7.0浓度为20 mmol/L Tris-HCl缓冲液作溶剂。将此溶液分别在25，27，29，31，33，35，37，39，41，43及45 ℃水浴中保温15 min，然后加入适量酶液，迅速摇匀后测定232 nm波长处的吸光度，计算单位时间吸收升高的单位。

2.6.2pH对酶活性的影响调整酶活测定体系的pH值，使其分别为6.2，6.4，6.6，6.8，7.0，7.2，7.4，7.6及7.8，30 ℃水浴中保温15 min，然后加入适量酶液，迅速摇匀后在分光光度计上测定232 nm波长处吸光度，计算单位时间光吸收升高的单位。

2.6.3离子强度调整酶活测定体系的离子强度，使其中NaCl的浓度分别为0，0.05，0.1，0.15，0.2，0.25，0.3，0.35及0.4 mol/L，30 ℃水浴中保温15 min，然后加入适量酶液，迅速摇匀后测定232 nm波长处的吸光度，计算单位时间吸收度升高的单位。

2.7酶稳定性研究

经过各种处理后，测定酶活性。与处理前对比，计算残留百分率。

2.7.1热稳定性纯化的酶液用20 mmol/L，pH7.0 的Tris-HCl缓冲液稀释后，分别置于15，35，45，55，65及75℃水浴中保温20 min，迅速冷却至25 ℃，测定酶活性。

2.7.2酸碱度稳定性分别配制下列缓冲液：柠檬酸缓冲液（pH 3.0～5.0）；磷酸缓冲液（pH 6.0～8.0）；硼酸缓冲液（pH 9.0～11.0）。用缓冲液稀释原酶20倍，在25 ℃的水浴中放置2 h和12 h后，测定酶活性。

2.8H2O2、NaN3和乙腈对肝素酶活性的影响

将酶液分成若干等份，分别加入H2O2（1 mmol/L，10 mmol/L），NaN3（10 mmol/L，100 mmol/L），和乙腈（1％，10％），对照只加入等量的水。在0℃放置30 min，测定各种处理后酶活性的变化。

2.9变性剂对肝素酶活性的影响

将酶液稀释在变性剂溶液中。变性剂溶液分别为SDS（1％），盐酸胍（1mol/L，4mol/L），尿素（1mol/L，4mol/L），在 0℃放置2 h后，测定酶的活性。

2.10金属离子对肝素酶活性的影响

把酶液分成若干等份，分别加入BaCl2（1 mmol/L），CaCl2（10 mmol/L），ZnCl2（1 mmol/L），MgCl2（1 mmol/L）CoCl2（1 mmol/L），MnCl2（1 mmol/L），CuCl2（1 mmol/L）， FeCl2（1 mmol/L），对照试样只加入等量的水。在0 ℃放置30 min后，测定酶活性。

3结果与讨论

3.1相对分子质量、等电点及N端蛋白序列的测定结果

SDS-PAGE电泳结果见图1。由图1可见，所得到的肝素酶已经达到电泳纯，肝素酶蛋白质的迁移率大约与43×103的兔肌动蛋白相等。

采用二维电泳法，所用胶为12%聚丙烯酰胺，等电聚焦的pH范围为3~10。根据目标蛋白质在其间的位置，可算得肝素酶的pI为8.5。

N端测定结果显示，无法由蛋白质获知其末端序列，该酶的N端处于封闭状态。

3.2肝素酶紫外吸收光谱的测定结果

测定结果见图2。由图2可见，酶的最大吸收处在280 nm。

图1 肝素酶电泳图（左为marker，右为肝素酶）

图2 肝素酶的紫外吸收光谱

3.3酸碱度和温度对酶活性的影响

等量的酶在不同pH缓冲液中的表观酶活测定结果见图3。由图3可见，在pH值6.4~7.0区间获得最大值，体系偏碱时，酶活性降低。

图4为等量的酶在不同温度下的表观酶活，由图4可见，在41℃时，酶反应速度最快，为最佳酶催化温度。

图3 不同pH下肝素酶的反应速度

图4 不同温度下肝素酶的反应速度

3.4离子强度对肝素酶活性的影响

结果见图5。由图5可见，在10 mmol/L缓冲液中反应时，添加一定量的盐类时，对酶活性提高有利。在NaCl浓度0~150 mmol/L的范围内，酶活性随离子强度增大而增大，最高增幅可达68%。当离子强度过高时，酶活性下降。

图5 离子强度对肝素酶活性的影响

3.5温度和酸碱度对肝素酶稳定性的影响

温度对肝素酶稳定性的影响结果见图6。由图6可见，肝素酶对温度十分敏感，当温度高于35 ℃时，30 min即可使酶失活80％；高于55 ℃时，30 min可使酶完全失活。

在pH 7~11范围内，酶在12 h内基本不损失活性，偏离此范围可引起较大的酶活损失。结果见图7。

图6 温度对肝素酶稳定性的影响

图7 pH对肝素酶稳定性的影响

3.6金属离子对酶活的影响

图8和图9为金属离子对酶活性影响的测定结果。由图8，9可见，CaCl2（10mmol/L）和MnCl2（1 mmol/L）对酶活性有较明显的促进作用，BaCl2（1 mmol/L），ZnCl2（1 mmol/L），MgCl2（1 mmol/L），CoCl2（1 mmol/L），CuCl2（1 mmol/L）均无明显作用，而FeCl2（1 mmol/L）呈明显抑酶活性。

由图9可见，CaCl2对酶有很强的激活作用，向酶液中添加5 mmol/L的CaCl2，可使单位酶活性提高50%以上，10 mmol/L的CaCl2能使酶活性提高120%，100 mmol/L的CaCl2能使酶活性提高180%。

图8 金属离子对酶活性的影响

图9 CaCl2对酶活性的影响

3.7H2O2，NaN3，乙腈及几种蛋白质变性剂对酶活性的影响

研究表明， H2O2（1 mmol/L，10 mmol/L），NaN3（10 mmol/L，100 mmol/L）、和乙腈（1％，10％）都对纯化的肝素酶的活性无影响。

几种变性剂对酶活性的影响有所不同，1 mol/L盐酸胍和1 mol/L尿素对酶活性无影响，而1％SDS、4 mol/L盐酸胍和4 mol/L尿素使酶完全失活，观察处理样品，发现产生了沉淀，认为由此引起酶失活。

参考文献

[1]Sasisekharan R, Moses M A, Nugent M A, et al. Heparinase inhibits neovascularization [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91(4): 1524-1528.

[2]Sasisekharan R, Moses M, Matthew A, et al. Method for inhibiting angiogenesis using heparinas [P]. US: 5567417, 1996-10-22.

[3]Liu D F, Kevin P, Zachary S, et al. Use of heparinase III in cancer treatment and inhibition of tumor cell growth [P].WO: 2001066772, 2001-09-13.(CA 2002, 135:221282p).

[4]马小来，袁勤生．微生物肝素酶研究进展[J]．中国医药工业杂志，2005，36（2）：119-122．

[5]马小来，袁勤生. 肝素黄杆菌肝素酶I的纯化[J]．食品与药品，2005，7（8）：40-42．

[6]Ma X L, Wang Z, Li S X, et al. Effect of CaCl2 as activity stabilizer on purification of heparinase I from flavobacterium heparinum [J]. Chromatography B, 2006, 843(2): 209-215 .

[7]Lowry O H, Roscbrough N J, Farr A, et al. Protein measurement with the folin phenol regent [J]. J Biol Chem, 1951, 193: 265-275.

[8]何忠效，张树政．电泳 [M]．第2版．北京：科学出版社，1999，127-130.

注：“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。”