非典型分支杆菌的分类鉴定方法研究进展

摘要：非典型分支杆菌与结核分支杆菌（Mycobacterium tuberculosis）复合群、麻风分支杆菌（M. leprae）同属于分支杆菌属（Mycobacterium）。随着对结核杆菌的深入研究，非典型分支杆菌也逐渐引起了人们的关注。为了对非典型分支杆菌进行系统的了解和分类鉴定，就国内外常用的分类鉴定方法进行了综述。

关键词：非典型分支杆菌；结核分支杆菌（Mycobacterium tuberculosis）；分类；鉴定

中图分类号：R378.91；C34 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）13-2977-03

非典型分支杆菌是指除了结核分支杆菌（Mycobacterium tuberculosis）复合群和麻风分支杆菌（M. leprae）之外的其他分支杆菌，包括偶发分支杆菌（M. fortuitum）、鸟分支杆菌（M. avium）、堪萨斯分支杆菌（M. kanasii）等30多种分支杆菌。非典型分支杆菌生长缓慢，具有一定的致病性，临床表征与结核分支杆菌相似，容易造成误诊。因此，对非典型分支杆菌的分类鉴定就显得尤为重要。本研究拟对临床中常用的分类鉴定方法进行综述，旨在为更深入的研究提供参考。

1 传统分类方法

培养分支杆菌常用的培养基有固体培养基，如改良罗氏培养基、匡氏琼脂PNB培养基和Middle brook 7H10、7H11琼脂培养基，在固体培养基中通过观察菌落形态和生长情况鉴定分支杆菌；液体培养基包括Sauton培养基和Middle brook 7H9等，细菌充分接触营养物质时易大量获得细菌，但缺点是易污染，需先进行涂片处理才能观察菌落形态。2008年Wang等[1]检查一位患者咽喉部病变时，经过组织切片和涂片后观察到侵染细菌与鸟分支杆菌复合群相一致。2010年Sajduda等[2]应用PRA（PCR restriction analysis）和传统分离方法鉴定64株分支杆菌，结果表明PRA优于传统方法和特殊DNA测序方法。Guarin等[3]在研究区分龟亚科分支杆菌-脓肿分支杆菌复合群时，对传统分类方法、高效液相色谱分析方法和实时PCR方法进行了比较试验。由于传统鉴定方法耗时长、对操作要求十分严格、培养物易受外界环境污染，所以在实际工作中不易被采用。高效液相色谱法虽然可被广泛应用于非结核性分支杆菌的分类鉴定，但是该方法不能将龟亚科分支杆菌-脓肿分支杆菌复合群里的成员区分开。相对前两种方法，采用实时PCR方法更为快捷省时、操作简单，大大提高了工作效率。

2 全自动分支杆菌快速生长培养仪检测方法

20世纪70年代末，BD公司研制的BACTEC 460-TB成为全球第一台专业的全自动分支杆菌培养鉴定仪，该系统培养基以Middle brook 7H12为基础，在培养基中加入标记14C的棕榈酸，因此也称为放射性同位素液体培养法。张敦熔[4]在Middle brook系列培养基中加入NAP及其他选择性抑制剂，将培养出来的细菌经过分析仪检测能够快速鉴定出结核与非结核分支杆菌，该技术解决了传统培养方法耗时费力的缺点，使细菌快速培养成为现实。Kontos等[5]应用全自动分支杆菌快速生长培养仪BACTEC MGIT960和PCR-RFLP相结合的方法检测从临床样本中分离到的分支杆菌，检测结果与常规生化试验检测结果相一致，但在检测的敏感性和时间上明显优于常规检测方法。

3 噬菌体分析方法

胡忠义等[6]应用分支杆菌噬菌体D29采用噬菌体生物扩增法鉴定结核和非结核分支杆菌，经过37 ℃感染1 h，结果结核分支杆菌生物扩增检测为阳性，非结核分支杆菌检测为阴性。吕斌等[7]应用基因工程技术构建可表达荧光素酶的结核分支杆菌重组噬菌体。由于噬菌体具有特异性强、灵敏度高的特点，且不同的分支杆菌发光水平不同，因此重组噬菌体分析方法是一种鉴别结核和非结核分支杆菌的有效方法。

4 聚合酶链式反应技术

聚合酶链式反应（PCR）技术已广泛应用于分子生物学领域。由于PCR技术具有快速、灵敏度高、操作简单等优点，在分支杆菌鉴定方面也是一种常用的鉴定方法。李国利等[8]利用双重PCR技术寻找结核与非结核分支杆菌之间的特异性条带，旨在快速鉴定结核与非结核分支杆菌。侯瑞生等[9]利用多重PCR体系将临床病例标本和标准菌株进行检测比较，结果显示对病例标本和标准菌株的检测灵敏度达到94.6%，特异性达到100.0%。吴雪琼等[10]利用不同细菌的单链DNA构象不同的特点，建立了PCR-SSCP单链构象多态性聚合酶链式反应体系，用以区别结核与非结核分支杆菌。Yamada-Noda等[11]根据dnaJ基因建立PCR反应体系。结果表明，在54株模式株中，dnaJ的同源性为80.4%，低于16S rRNA的96.6%、rpoB的91.3%和hsp65的91.1%，dnaJ PCR技术可以作为一种新的方法区别结核与非结核分支杆菌，利用通用引物建立PCR反应体系并进行测序分析可以准确地鉴定出多种分支杆菌。Selvaraju等[12]利用hsp65基因限制性分析龟亚科分支杆菌复合群，该方法根据hsp65基因的多态性可以将复合群里的每种菌株分别鉴定出来。Martin等[13]利用生化方法、hsp65基因PCR-RFLP和PRA技术鉴定从人类临床标本中分离出分支杆菌，结果表明，相对一般生化方法，PRA技术操作简单、方便、快捷，是一种可靠的鉴定方法。Sajduda等[14]应用PRA配合毛细管电泳法，分离鉴定出27株堪萨斯分支杆菌和29株龟分支杆菌-脓肿分支杆菌复合群。结果表明，PRA技术配合毛细管电泳法能够快速准确地鉴定分支杆菌。

5 核酸探针技术

核酸探针技术是将一段带有标记的核酸片段在一定的温度、pH等条件下与核酸互补链通过氢键结合形成稳定的复合物结构，经过显影技术显示结果。李国利等[15]以16 S-23 S rDNA内转录间隔区序列为靶基因设计核酸探针，利用PCR-反向杂交技术可以将分支杆菌鉴定到种的水平。还可以利用生物素标记临床样本的核酸制成探针，与标准菌株DNA杂交，以大肠杆菌作为阴性对照，可以快速将细菌鉴定到种。梁建琴等[16]运用16 S rRNA-寡核苷酸探针反向杂交阵列法检测临床样本中的分支杆菌，结果显示寡核苷酸探针特异性强、检测灵敏度高，可作为鉴定临床分支杆菌菌种的方法。Tobler等[17]采用hsp65实时PCR和DNA微阵列法快速检测37株分支杆菌，结果鉴定出34株分支杆菌，与16 S rRNA的测序结果一致。Sun-Joon等[18]采用rpoB PCR-反向DNA寡核苷酸特异性探针鉴定分支杆菌，从504株临床样本中分离出48株鸟分支杆菌和60株胞内分支杆菌，其他菌株经鉴定分别为366株结核分支杆菌、9株脓肿分支杆菌、8株偶发分支杆菌、2株浅黄分支杆菌和11株外来分支杆菌。该方法快速、准确、敏感度高、特异性强。

6 细胞脂肪酸成分分析方法

将细菌制成冻干粉后，将粉末经过甲酯化，供气相色谱仪或色谱/质谱仪（GC/MS）分析，由于非结核分支杆菌含有结核分支杆菌所没有的特征脂肪酸，经过仪器分析鉴定出异十六烷酸、异十七烷酸、十六烯酸、十八烯酸、十八二烯酸等成分，进一步探明了其组分的化学本质，鉴定出戈登分支杆菌（M. gordonae）无结核分支杆菌硬脂酸，牛型结核分支杆菌（M. bovis）没有α-甲基十八烯酸，为分支杆菌脂肪酸分析提供了科学依据。美国MIDI公司生产的全细胞脂肪酸分析系统，通过使用安捷伦的气相色谱、MIDI微生物数据库和MIDI图谱识别软件来鉴定每个菌株，对菌株的鉴定表现得更为客观，减少了人为因素造成的错误，并能鉴定到种的水平。

7 气相色谱法和薄层层析法

将气相色谱法与传统生物学鉴定方法进行对比，结果两种方法鉴定出的分支杆菌94.0%相符合。用气相色谱法和薄层层析法相结合将28种标准菌株中85.0%的菌株区分开来。另外，Rebuffo-Scheer等[19]利用傅里叶变换红外显微分光镜检查法鉴别分支杆菌。利用红外线光谱得到的线性反应建立标准化模式，可以根据光谱分析快速检测临床标本的未知分支杆菌。

8 结语

临床中用于鉴定非典型分支杆菌的方法很多，以上介绍的是国内外较为常用的几种分类鉴定方法。每种方法都有其优缺点，因此，往往根据实际需要采用几种方法联合应用，如利用传统培养方法进行培养，再配合PCR技术、核酸探针技术进行鉴定，或者利用PCR技术与反向核酸探针技术相结合的方法，能够更加系统、全面地对非典型分支杆菌进行分类鉴定，对临床研究非典型分支杆菌有很大的帮助。

参考文献：

[1] WANG B Y， AMOLAT M J， WOO P， et al. Atypical mycobacteriosis of the larynx： An unusual clinical presentation secondary to steroids inhalation[J]. Annals of Diagnostic Pathology，2008，12（6）：426-429.

[2] SAJDUDA A， MARTIN A， PORTAELS F， et al. hsp65 PCR-restriction analysis（PRA） with capillary electrophoresis in comparison to three other methods for identification of Mycobacterium species[J]. Journal of Microbiological Methods， 2010， 80（2）：190-197.

[3] GUARIN N， BUDVYTIENE I， GHAFGHAICHI L， et al. Comparison of real-time polymerase chain reaction and conventional biochemical methods for identification of Mycobacterium chelonae-Mycobacterium abscessus group to the species level[J]. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease，2010， 67（4）：333-336.

[4] 张敦熔.现代结核病学[M].北京：人民军医出版社，2000.17-19.

[5] KONTOS F， PETINAKI E， GITTI Z， et al. Combined use of the fully automated Bactec MGIT 960 System and a PCR-restriction fragment length polymorphism analysis for routine detection and identification of mycobacteria from clinical samples[J]. Journal of Microbiological Methods，2003，52（1）：137-140.

[6] 胡忠义，倪莲娣，张莹蓉，等.噬菌体生物扩增法在分支杆菌鉴定和药敏试验中的应用[J].中国防痨杂志，2003，25（Z1）：63-64.

[7] 吕 斌，符志军，徐顺清，等.利用重组分支杆菌噬菌体快速筛选耐利福平结核分支杆菌[J].中华结核和呼吸杂志，2000，23（8）：480-484.

[8] 李国利，庄玉辉，赵 铭，等.应用双重PCR技术快速鉴定结核与非结核分支杆菌[J].中国现代医学杂志，2000，10（1）：14-15，18.

[9] 侯瑞生，王 丽，陈文玲，等.多重聚合酶链反应方法在结核杆菌检测中的应用[J].中国国境卫生检疫杂志，2007，30（6）：387-388.

[10] 吴雪琼，张俊仙，刘佳文，等.PCR-SSCP分支杆菌菌种初步鉴定方法的建立及其应用[J].中国现代医学杂志，2000，10（7）：25-26.

[11] YAMADA-NODA M，OHKUSU K， HATA H， et al. Mycobacterium species identification ——A new approach via dnaJ gene sequencing[J]. Systematic and Applied Microbiology，2007，30（6）：453-462.

[12] SELVARAJU S B，KHAN I U H， ADAV J S. A new method for species identification and differentiation of Mycobacterium chelonae complex based on amplified hsp65 restriction analysis（AHSPRA）[J]. Molecular and Cellular Probes，2005，19（2）：93-99.

[13] MARTIN A， UWIZEYE C， FISSETTE K， et al. Application of the hsp65 PRA method for the rapid identification of mycobacteria isolated from clinical samples in Belgium[J]. Journal of Microbiological Methods，2007，71（1）：39-43.

[14] SAJDUDA A， MARTIN A， PORTAELS F， et al. hsp65 PCR-restriction analysis （PRA） with capillary electrophoresis for species identification and differentiation of Mycobacterium kansasii and Mycobacterium chelonae-Mycobacterium abscessus group[J]. International Journal of Infectious Diseases， 2012，16（3）：193-197.

[15] 李国利，庄玉辉，赵 铭，等.16S-23S rDNA内转录间隔区序列寡核苷酸探针鉴定分支杆菌菌种的研究[J].中国防痨杂志，2002，24（Z1）：12-16.

[16] 梁建琴，吴雪琼，张俊仙，等.应用聚合酶链反应-膜芯片技术快速鉴定分支杆菌菌种[J].河北医科大学学报，2004，25（5）：289-292.

[17] TOBLER N E，PFUNDER M，HERZOG K，et al. Rapid detection and species identification of Mycobacterium spp. using real-time PCR and DNA-Microarray[J]. Journal of Microbiological Methods，2006，66（1）：116-124.

[18] SUN-JOON B， JIN-SEONG E， YOUNG-DOO P， et al. PCR-linked reverse DNA hybridization using oligonucleotide-specific probes of rpoB for identification of Mycobacterium avium and Mycobacterium intracellulare[J]. Journal of Microbiological Methods，2010，83（3）：291-295.

[19] REBUFFO-SCHEER C A，KIRSCHNER C， STAEMMLER M， et al. Rapid species and strain differentiation of non-tubercoulous mycobacteria by fourier transform infrared microspectroscopy[J]. Journal of Microbiological Methods，2007，68（2）：282-290.