利用计算机快速检测禽流感病毒研究

免疫磁分离技术具有简单、快速、特异性强等优点,与其它检测方法(如电化学、PCR、ELISA等)联用,已广泛应用于细胞的分离提纯、靶向释药、致病菌检测等研究领域。实验中以灭活的AIVH5N1为检测对象,首先在H5抗体表面偶联生物素,使之与表面修饰链霉亲和素的150nm磁珠结合,以实现对AIVH5N1的纯化和富集。在最佳实验条件下,对纯病毒样品和鸡的咽拭子样品进行了检测。

1摇实验部分

1.1摇仪器与试剂

金叉指阵列微电极(中国科学院半导体研究所),指电极对数为25对,基底为石英片(3cm伊1cm),指电极的宽度和间距均为15滋m,厚度为0.2滋m,长度为3mm。链霉亲和素修饰的纳米磁珠(直径150nm,美国R&D公司);生物素化试剂Sulfo鄄NHS鄄Biotin、透析卡(美国Pierce公司);KPL洗液(美国KPL公司),本实验中使用的测量溶液为KPL洗液按1颐200000稀释而成;磷酸盐缓冲液(PBS,美国Sigma公司),本实验中使用的PBS缓冲液浓度为10mmol/L,pH为7.4;牛血清蛋白(BSA,北京博翔兴旺科技有限公司);无水乙醇(分析纯,北京化工厂);NaOH、HCl(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);实验用水均由美国Millipore公司生产的Mill鄄Q制得(18.2M赘•cm)。抗H5亚型AIV单克隆抗体、灭活的AIVH5N1/H1/H9亚型病毒、灭活的新城疫病毒、健康鸡的咽拭子皆由华南农业大学兽医学院提供。实验中纯病毒样品采用PBS缓冲液按浓度梯度对原病毒溶液进行稀释;拭子样品采用健康鸡的咽拭子在PBS缓冲液中的浸出液按浓度梯度对原病毒溶液进行稀释。

1.2摇检测原理及过程

本研究的实验过程(图1)主要包括4个步骤:生物素化抗体、制备H5抗体包被的免疫磁珠、捕获并分离目标病毒、阻抗测量。Sulfo鄄NHS鄄Biotin可与蛋白质链上的氨基形成稳定的酰胺键,从而对H5抗体进行标记。通过生物素与链霉亲和素之间的高度亲和力,使标记生物素的H5抗体与表面修饰链霉亲和素的150nm磁珠结合,形成H5抗体包被的免疫磁珠。当样品中存在目标病毒AIVH5N1时,免疫磁珠能够捕获H5N1病毒,形成磁珠鄄抗体鄄病毒复合物。该复合物在外加磁场作用下定向移动并吸附于管壁内侧后,移除废液,从而实现了目标病毒与样品中其它非目标分析物的分离。对照品悬液在制备过程中使用PBS缓冲液替代病毒溶液,其它制备步骤与上述样品悬液的制备步骤相同。采用叉指阵列微电极分别测量对照品和样品的阻抗谱,通过两者间的差值判断样品中是否含有H5N1病毒。

1.3摇实验方法

1.3.1摇生物素化抗体摇

将3滋LSulfo鄄NHS鄄Biotin溶液(10mmol/L)和100滋LH5抗体溶液(1.5g/L)加入200滋LPBS缓冲液中,室温下孵育1h,使生物素偶联到H5抗体表面。然后用1mL注射器将其注入透析卡内,浸入PBS缓冲液于室温下透析2h后,更换PBS缓冲液于室温下继续透析,经过2h后,更换PBS缓冲液在4益下透析12h,以去除没有偶联到抗体上的过量的Sulfo鄄NHS鄄Biotin。最后,将偶联生物素的抗体溶液从透析卡中移出,用PBS缓冲液将其稀释1倍,置于4益环境下保存备用。

1.3.2摇免疫磁分离摇

将25滋L表面修饰链霉亲和素的150nm磁珠、50滋L生物素化的抗体溶液和100滋LPBS缓冲液加入经1%BSA封闭的1.5mL离心管内,置于旋转混合器中以15r/min的速度旋转混合,利用生物素与链霉亲和素之间的高度亲和力,将H5抗体连接到150nm磁珠表面。旋转混合30min后,将离心管置于磁分离器中进行磁分离,移除废液,即完成了免疫磁珠的制备。在免疫磁珠中加入200滋LPBS缓冲液为对照品,加入200滋L病毒溶液作为待测样品,于室温下旋转混合,样品中的目标病毒与磁珠表面的抗体发生免疫结合后,采用磁分离器进行磁分离并移除废液。在对照品和样品中均加入150滋L测量溶液,经旋涡混合器混合10s后,即可直接进行阻抗测量或于4益下保存备用。

1.3.3摇电极清洗摇

将金叉指阵列微电极置于1mol/LNaOH、1mol/LHCl溶液中分别浸泡5min,然后用蘸有无水乙醇的擦镜纸轻轻擦拭电极表面,超纯水彻底冲洗后用氮气吹干,即得到表面洁净的金电极。

1.3.4摇阻抗测量摇

将25滋L对照品或样品悬液直接滴加到洁净的叉指阵列微电极表面进行阻抗测量,测量频率范围为20Hz~1MHz,外加交流电压幅值为50mV,记录Bode阻抗谱(阻抗模值vs频率)。

2摇结果与讨论

2.1摇抗体浓度对阻抗信号的影响

研究了抗体浓度对阻抗信号大小的影响,阻抗信号定义为100kHz频率下被测样品与对照品阻抗模值的差值。先将免疫反应时间固定为90min,磁分离时间固定为5min,以浓度为22HAunit/50滋L的纯病毒悬液作为被测样品。分别用0.025,0.05,0.125,0.25和0.5g/L抗体制备免疫磁珠,并进行病毒分离和阻抗测量。由图2可见,阻抗信号随抗体浓度增加而增大,当抗体浓度为0.25g/L时,阻抗信号达到最大值。因此,本实验选择的最佳抗体浓度为0.25g/L。

2.2摇免疫反应时间对阻抗信号的影响

本实验研究了免疫反应时间(20,30,50,60,90和120min)对阻抗信号的影响,实验反应条件为:抗体浓度0.25g/L、磁分离时间5min、纯病毒样品浓度22HAunit/50滋L。结果如图3所示,随着免疫反应时间的延长,阻抗信号不断增大,当免疫反应时间超过60min后,阻抗信号随反应时间的增加变得缓慢。因此,考虑到尽量缩短测量时间,将免疫反应时间定为60min。

2.3摇磁分离时间对阻抗信号的影响

在不同的磁分离时间(1,2,3,4和5min)下,测定阻抗信号的大小,实验反应条件为:抗体浓度0.25g/L、免疫反应时间60min、纯病毒样品浓度22HAunit/50滋L。结果表明,阻抗信号随磁分离时间的延长而增大,3min后达到平衡,阻抗信号值基本保持不变。因此,本实验确定磁分离时间为3min。

2.4摇禽流感H5N1亚型病毒的检测

在上述优化的实验条件下,测量了浓度(2-3~24HAunit/50滋L)纯病毒样品和拭子样品的阻抗谱,结果如图4所示。阻抗模值随H5N1病毒浓度的增加而升高,样品中AIVH5N1引起阻抗模值的差异在频率100kHz处最为显著,因此将100kHz确定为本实验的特征频率。在特征频率下,通过计算样品与对照品的阻抗差值确定阻抗信号值,在相同条件下将每个浓度的病毒样品重复制备并测量3次,计算阻抗信号的平均值,其标准差如图5中误差棒所示。当纯病毒样品中H5N1病毒浓度在2-1~24HAunit/50滋L范围内,阻抗信号值(吟Z)与病毒浓度(C)的对数值呈线性关系,线性回归方程为吟Z=487.8log2C+1243.4(R2=0.9022),检出限为0.5HAunit/50滋L;当拭子样品中H5N1病毒浓度在20~24HAunit/50滋L范围内,阻抗信号值(吟Z)与病毒浓度(C)对数值的线性相关方程为吟Z=388.3log2C+389.8(R2=0.9273),检出限为2HAunit/50滋L。

2.5摇特异性分析

采用免疫磁分离技术分别制备对照品、浓度为22HAunit/50滋L的AIVH1,H9和ND的纯病毒样品悬液,并测量其在特征频率下的阻抗模值。非目标病毒AIVH1,H9和ND均不会引起明显的阻抗变化,此病毒检测方法具有良好的特异性。

3结论

建立了免疫磁分离和阻抗测量技术检测禽流感H5亚型病毒的方法,可快速、准确地检测纯病毒样品和鸡的咽拭子样品中的H5N1病毒。在特征频率下分析样品中不同浓度H5N1病毒引起的阻抗变化。对纯病毒样品和拭子样品进行检测,检出限分别为0.5和2HAunit/50滋L。本方法不仅灵敏度高、特异性好,而且操作简便、检测速度快,在病原微生物快速检测领域具有广泛的应用前景。

作者：颜小飞汪懋华温新华安冬单位：中国农业大学教育部现代精细农业系统集成研究重点实验室