肠道病毒71VP1基因的克隆与原核表达载体构建

摘要：手足口病是由人肠道病毒引起的一种儿童常见传染病，主要由肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型引起。近年来，尤其是肠道病毒71引发的手足口病在亚太地区呈上升趋势。本研究采用RT-PCR技术，设计特异性引物扩增EV71VP1基因序列，克隆至原核表达载体pET32a（+）中，以期为今后肠道病毒EV71新型疫苗的开发提供技术基础。

关键词：手足口病；EV71；原核表达载体构建

中图分类号：R725.1 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20170132011

手足口病（Hand-foot-mouth Disease，HFMD）是由柯萨奇病毒A4、A5、A8、A10、A16、B3、B7和肠道病毒71型等多种人肠道病毒引起的一种儿童常见传染病，其中引起手足口病疫情的病原体以肠道病毒71型（EV71）、柯萨奇病毒A组16型（cOXAl6）最为常见。大多数患者症状轻微，以发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹为主要症状。通常情况下，两者引起的手足口病在临床症状等方面难以区别，但EV71感染除了引起HFMD外，还能够引起无菌性脑膜炎、脑干脑炎和脊髓灰质炎样麻痹等多种与神经系统相关的较为严重的症状。自1974年Schmidt等首次报道从美国加利福尼亚暴发表现为神经系统症状疾病的患者中分离到EV71病毒以来，EV71病毒已在世界范围内引起十多次暴发与流行。近年来，EV71病毒的流行在亚太地区呈上升趋势。自2008年3月以来，我国多个省份出现了手足口病的流行，引起社会高度重视。

由于手足口病潜伏期长，症状不明显，不易被发现，因而极易延误疾病治疗，目前国内外尚无相关疫苗类药物面世。EV71保守序列VPI编码病毒结构蛋白，具备抗原特异性，本研究采用RT-PCR技术，设计特异性引物扩增EV71 VP1基因序列，克隆至原核表达载体pET32a（+）中，以期为今后肠道病毒EV71新型疫苗的开发提供技术基础。

1材料与方法

1.1试验材料

EV71病毒RNA、大肠杆菌DH5 α和原核表达载体pET32a（+）为本实验室保藏；RT-PCR试剂、限制性内切酶EcoR I和Xho I购自宝生物工程（大连）有限公司；T4DNA连接酶，质粒提取试剂盒购自上海生工生物工程技术有限公司。

1.2引物设计

根据GenBank中EV71 VP1（AB204852.1）

基因序列（891bp），设计VP1上下游引物。上游引物：5’-GGAATTCCTCTACCAGCACCCACAGGC-3’（加入限制性酶切位点EcoR I）；下游引物：5’-CTCGAGGCATCGGGCGAGGTATCCAC-3’（加入限制性酶切位点Xho I）。

1.3VPl基因扩增

1.3.1反转录反应

10μL反应体系，其中病毒RNA 2.5μL，AMV反转录酶0.5μL，10×RT buffer2μL，dNTPMix 1μL，Oligo-dT 0.5μL，Rnaes抑制剂0.5～tL，Nuclease-free水3μL。70℃变性退火5min，42℃反转录反应45min，70℃保5min终止反应。

1.3.2PCR反应

50μL反应体系，10×buffer 5μL，dNTP 4μL，上下游引物各1μL，反转录产物5μL，DNA聚合酶1μL，双蒸水33μL。反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30循环，72℃终延伸5min。产物使用琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.4pET32a（+）-VP1原核表达载体构建

扩增片段鉴定正确后，使用限制性内切酶EcoR I和Xho 1分别对VP1扩增片段与原核表达载体pET32a（+）进行双酶切反应，反应条件为37℃，120min，65℃灭活20min。胶回收VP1扩增片段与pET32a（+）酶切产物，使用T4DNA连接酶在16℃下进行连接反应，过夜。然后将连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞DH5 α后，挑取单克隆进行双酶切鉴定后送至上海生工生物工程技术有限公司测序，测序结果通过Bioedit软件比对。

2结果与分析

2.1VPl基因RT-PCR扩增产物的鉴定

VP1基因RT-PCR扩增产物经过1%琼脂糖凝胶电泳检测，目的条带位于1200bp与800bp之间（图1），与预期大小732bp一致。

2.2重组质粒pET32a（+）-VP1的鉴定

使用限制性内切酶EcoR I和Xho I对重组质粒pET32a（+）-VP1进行双酶切，酶切产物经过0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，分别得到的2条产物片段大小与VPl片段和pET32a（+）载体大小一致，测序结果表明VPl片段与Genebank中的VP1序列同源性为99%，表明重组原核表达载体pET32a（+）-VPl构建成功。

本研究采用RT-PCR技术，设计特异引物扩增EV71VPl基因序列，通过限制性内切酶EcoR I和Xho I的双酶切反应和T4DNA连接酶的连接反应，将VP1片段克隆至pET32a（+）中，经过双酶切与DNA测序鉴定，表明VP1片段成功被克隆至原核表达载体pET32a（+）中。在本研究的基础上，可以进一步进行VP1蛋白纯化，抗血清制备及其免疫原性分析，从而为今后肠道病毒EV71新型疫苗的开发提供技术基础。