子宫腺肌病中孕激素受体亚型表达的研究

【摘要】 目的 研究子宫腺肌病中孕激素受体亚型的表达，探讨孕激素受体亚型(hPR)在子宫腺肌病发病中的作用机制。方法 运用免疫蛋白印迹法(Western blot)和RT-PCR方法测定子宫腺肌病患者（24例）病灶及其在位内膜及对照组（19例）子宫内膜标本中孕激素受体亚型在蛋白和mRNA水平的表达，计算机图像分析、半定量研究孕激素受体亚型的表达。结果 子宫腺肌病异位内膜中hPRs的表达均明显低于在位内膜和对照组，研究组在位或异位内膜中，hPR-A含量均高于hPR-B；而在mRNA水平上则差异无统计学意义(P>0．05)。结论 子宫腺肌病异位内膜hPRs蛋白的表达均明显低于在位内膜，而在mRNA水平上却无显著性差异；hPR蛋白的活性可能受转录后调节。

【关键词】子宫腺肌病；人孕激素受体亚型；免疫蛋白印迹法；反转录聚合酶链反应

Study on expression of human progesterone receptor isoforms in adenomyosis

LU Xiao-yuan.Department of Obstetrics and Gynecology, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221002, China

【Abstract】 Objective To study the expression and the mechanism of human progesterone receptor(hPR) isoforms in adenomyosis.Methods Western blot and RT-PCR were employed to investigate the expression of hPR isoforms in ectopic lesion from adenomyosis and normal endometrium from puter densitomitry was used to study the relative expression of the hPR isoforms at protein and mRNA levels.Results The expressions of hPR isoforms are lower inadenomyosis than in endometrium(P

【Key words】Adenomyosis;Human progesterone receptor isoforms; Western blot; RT-PCR

子宫腺肌病（adenomyosis）是指子宫内膜腺体及间质侵入子宫肌层并在其中生长所致，其明显的临床症状严重地影响生育年龄妇女的健康。虽然，它表现为一种性激素依赖性疾病，但是，具体的病因和发病机制目前尚未完全明确。研究发现，临床上该疾病孕激素治疗仍存在着疗效反应差的现象，而孕激素受体拮抗剂米非司酮对子宫腺肌病有一定的治疗作用[1]，推测可能由于孕激素受体亚型（hPR）存在着不同的转录活性及其组织特异性所致。本研究通过对子宫肌瘤中孕激素受体亚型的表达，探讨其在子宫腺肌病发病中的作用及可能的耐药机制。

1 资料和方法

1．1 一般资料 收集2006年2月至2007年10月在徐州医学院附属医院妇产科，因子宫腺肌病行全子宫切除术患者的标本24例作为研究组，平均（43．7±4．3）岁；另取同期住院因子宫肌瘤或宫颈病变行子宫切除 19例作为对照组，平均（44．3±5．4）岁。两组均为绝经前妇女，有临床症状但月经周期规律，术前至少6个月未接受性激素治疗，通过末次月经时间和术后子宫内膜病理证实为增殖期。两组患者在年龄上差异无统计学意义(P>0．05)。

1．2 方法

1．2．1 标本处理 取研究组患者在位子宫内膜和异位病灶组织、对照组子宫内膜组织各0．5 g低温（-70℃）冻存。分别行组织蛋白及总RNA的提取。

1．2．2 主要试剂和引物 小鼠抗人孕激素受体单克隆抗体，北京市肿瘤所免疫室提供；生物素化羊抗小鼠Ig-G，华美生物公司；辣根酶标记链亲和素，中山生物公司；中分子量蛋白标准及DAB显色试剂盒，华美生物公司。Trizol试剂盒，Gibco公司；逆转录酶MML-V，Promega公司；Taq酶，Promega公司；随机引物，Promega公司；dNTP，Boehringere Mannheim公司；PCR分子量标准，华美生物公司。根据孕激素受体的cDNA序列[2]，应用赛百盛公司的引物设计软件包，设计并合成引物序列如下： hPR-B特异cDNA区域的上、下游引物序列分别为：5-TCATGACTGAGCTGAAGGCAAAG-3、5-GAGCTGTCTCCAACCTTGCAC-3；hPR-A和hPR-B共同cDNA区域的上、下游引物序列分别为：5-TCATGAGCCGGTCCGGGTGCAAG-3、5-CGGGGTGGACGAGGCACAGG-3；内参照β-actin的上、下游引物序列为：5-ATCTGGCACCACACCTTC-3、5-AGCCAGGTCCAGACGCA-3。

1．2．3 Western blot实验 将组织蛋白提取液定量测定后，依次行SDS-PAGE电泳、湿式转膜、抗原-抗体反应、显色，用GEL DOC1000图像分析系统对条带进行扫描，计算其积分光密度值。

1．2．4 RT-PCR实验 取组织RNA提取物进行逆转录为cDNA，行PCR扩增反应：hPR-B特异序列的扩增条件：94℃预变性1 min；循环条件，94℃变性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35个循环；72℃后延伸5 min。hPR-A和hPR-B共同序列的扩增条件：94℃预变性5 min；循环条件，94℃变性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35个循环；72℃后延伸10 min。β-actin的扩增条件：94℃预变性6 min；循环条件，94℃变性30 s，57℃退火40 s，72℃延伸40 s，共35个循环；72℃后延伸6 min。PCR产物分析：6%聚丙烯酰胺凝胶电泳，显色，GEL DOC1000图象分析系统对条带进行扫描，计算其积分光密度值。

1．3 统计学方法 两均数间采用方差分析，P

2 结果

2．1 Western blot 实验结果 子宫腺肌病异位病灶、在位内膜及对照组子宫内膜中hPR及各亚型蛋白印迹条带积分光密度值的比较见表1。

由表1可以发现，hPR-A，hPR-B在研究组异位病灶、在位内膜及对照组内膜均有表达。异位病灶中hPR及各亚型的表达均显著低于其在位内膜及对照组内膜（P0．05）。

2．2 RT-PCR 实验结果 子宫腺肌病异位病灶、在位内膜及对照组子宫内膜hPRs mRNA条带积分光密度值的比较见表2。

由表2可以发现，子宫腺肌病异位病灶、在位内膜及对照组子宫内膜hPRs mRNA条带积分光密度值之间的比较，差异无统计学意义（P>0．05）。

3 讨论

孕激素通过与其配体结合后，与相应激素反应元件结合而发挥其生物学效应，影响其他蛋白的转录。孕激素受体亚型表达的研究是近年来关注的热点。体外研究实验表明：PR-B的转录活性强而PR-A是转录抑制性亚型，能抑制甾体激素受体的转录活性[3]。由于hPR各种亚型的转录活性不同，其组成的比例直接影响孕激素的生物学效应。研究组织中hPR亚型的差异，对明确腺肌病的发病机制和提供临床药物治疗依据有着非常重要的意义。

本实验结果表明，在子宫腺肌病异位病灶中hPRs的表达明显低于在位内膜( P

本实验运用RT-PCR研究A、B亚型的mRNA发现，无论在腺肌病的异位病灶或是在位内膜中，PR-A与PR-B亚型mRNA的含量均无显著差异，而且两种组织的hPR mRNA含量间亦无显著差异。对于hPRs在蛋白水平和mRNA水平上表达的不一致性，有学者认为PR蛋白的活性受转录后调节，这是对A、B两种启动子转录功能差异的补充[6]。

本研究结果发现，hPR及其亚型在蛋白水平均表现为异位内膜孕激素受体蛋白明显低于在位内膜，尤其是PR-A蛋白的低水平，使得孕激素不能充分发挥其抑制上皮细胞增生的作用，间质不能产生抑制信号而致内膜上皮持续增生，在子宫腺肌病的发病中产生重要的作用；同时，这种异位内膜组织中PR的低表达，致使其与外源性孕激素类药物结合发挥作用的能力减弱，可能与子宫腺肌病病灶孕激素治疗不敏感有关。

参考文献

［1］ KettelLM, Murphy AA, Morales AJ, et al.Treatment of endometriosis with antiprogesterone mifepristone（RU-486）.Fertil Steril, 1996,65(1):23-28.

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［3］ Mulac JB, Conneely OM.Reproductive tissue selective action of progesterone receptors.Reproduction, 2004, 128:139-146.

［4］ Moto PA, Balleine RL, Mcgowan EM, et al.Colocalization of progesterone receptors A and B by dual immunofluorescent hisochemstry in human endometrium during the menstral cycle.J Clin Endocrinol Metab, 1999, 84:2963-2971.

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