14―脱羟―11,12―二脱氢穿心莲内酯对糖尿病大鼠血糖及肿瘤坏死因子―α的影响

[摘要] 目的 观察14-脱羟-11，12-二脱氢穿心莲内酯对链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）所致的糖尿病（diabetes mellitus，DM）大鼠血糖及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的影响。 方法 采用腹腔注射STZ建立DM模型，将成模大鼠随机分为模型组、低剂量组、高剂量组，并设正常对照组。给药14 d后，断尾采血测血糖，苏木精和伊红（HE）染色观察胰岛的形态，免疫组织化学检测TNF-α的表达。 结果 与正常组比较，模型组血糖明显升高（P < 0.05），胰腺组织病理损害严重，TNF-α表达呈强阳性；与模型组比较，低、高剂量组血糖均下降（P < 0.05），胰腺组织病理损害减轻，TNF-α表达下调。 结论 糖尿病时胰岛β细胞中的TNF-α表达增高，14-脱羟-11，12-二脱氢穿心莲内酯可降低血糖，下调TNF-α的表达，减轻胰腺的病理损伤，改善胰岛功能。

[关键词] 穿心莲内酯；糖尿病；肿瘤坏死因子-α；胰岛β细胞

[中图分类号] R286 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）03（a）-0017-03

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一种以慢性高血糖为特征的代谢紊乱性疾病，其发生发展有多种病理生理过程的参与，其中，炎症反应正引起人们的广泛关注。穿心莲属爵床科植物，其化学成分主要为内酯类和黄酮类，有清热解毒、凉血消肿等功效。内酯化合物主要含于穿心莲叶中，主要成分有：穿心莲内酯（andrographolide）、新穿心莲内酯（neoandrographolide）、去氧穿心莲内酯（deoxyandrographolide）、脱水穿心莲内酯（dehydroandrographolide）[1]。穿心莲具有解热抗炎、抗病毒、保肝利胆、抗肿瘤、免疫调节、抗生育、降血糖、防治心血管病等药理作用[2]。14-脱羟-11，12-二脱氢穿心莲内酯是穿心莲内酯的一种成分，属于脱水穿心莲内酯。有研究表明，穿心莲水煮液有降血糖的作用[3]。为进一步了解穿心莲的降血糖的有效成分及可能机制，本研究通过链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）建立糖尿病大鼠模型，观察14-脱羟-11，12-二脱氢穿心莲内酯对糖尿病大鼠血糖、胰岛组织形态、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）表达的影响，以探讨14-脱羟-11，12-二脱氢穿心莲内酯抗炎作用与降血糖和胰岛保护的关系。

1 材料与方法

1.1 动物

健康雄性SD大鼠52只，体重（220±20）g，清洁级，购自山西医科大学实验动物中心。

1.2 试剂药品与仪器

链脲佐菌素，购自美国Sigma公司；14-脱羟-11，12-二脱氢穿心莲内酯-3，19- 二琥珀酸半酯钾钠盐，购于哈医集团三精加滨药业有限公司（批号：201102081）；TNF-α一抗，购于武汉博士德生物工程有限公司（编号BA0131）；SV-0002两步法免疫组化检测试剂盒，购于武汉博士德生物工程有限公司；二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒，购于武汉博士德生物工程有限公司（编号：AR1022）；三诺安稳血糖仪和试纸条，购自长沙三诺生物传感技术股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 糖尿病大鼠模型的制备 将52只健康雄性SD大鼠，适应性喂养1周。禁食12 h测空腹血糖，选择空腹血糖正常的大鼠50只，将其中10只作为正常对照组，其余40只大鼠均一次性腹腔注射1% STZ 55 mg/kg（pH=4.5，0.1 mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，现配现用），5 d后断尾取血测空腹血糖。血糖值>16.7 mmol/L者为DM模型成立[4]。正常组给予1～2 mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。

1.3.2 分组与用药 选取成模大鼠36只，随机分为模型组、高剂量组、低剂量组，每组12只。成模后第2天，低剂量组给予14-脱羟-11，12-二脱氢穿心莲内酯100 mg/（kg・d），高剂量组给予14-脱羟-11，12-二脱氢穿心莲内酯200 mg/（kg・d），正常组和模型组给予等体积的生理盐水，每天5～6 mL腹腔注射，连续给药14 d。于给药结束后禁食12 h，断尾取血测血糖，麻醉后取胰腺，用4%多聚甲醛固定24 h后制成蜡块标本，用于做免疫组化、苏木精和伊红（HE）染色。

1.4 检测指标

1.4.1 血糖测定 断尾采血，采用血糖仪测血糖。

1.4.2 胰腺组织HE染色 将胰腺组织的蜡块标本切成4 μm厚的切片，切片常规脱蜡至水，苏木精染细胞核，伊红染细胞质，梯度酒精脱水，二甲苯透明后中性树胶封片。镜下观察胰岛形态。

1.4.3 胰腺TNF-α免疫组化 将胰腺组织的蜡块标本切成4 μm厚的切片，切片常规脱蜡至水，3%过氧化氢（H2O2）封闭内源性过氧化物酶，蒸馏水洗涤，抗原修复，封闭后依次加入TNF-α抗体、二抗孵育（用磷酸盐缓冲液PBS代替一抗作阴性对照），二氨基联苯胺（DAB）显色，镜下控制反应时间，蒸馏水终止，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明后封片。胞质内出现棕黄色或黄色颗粒为阳性反应。

1.5 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析法，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 14-脱羟-11，12-二脱氢穿心莲内酯对糖尿病大鼠血糖的影响

结果显示，模型组大鼠血糖水平与正常组比较明显升高（P < 0.05）；给药14 d后，高剂量组和低剂量组大鼠血糖水平与模型组比较明显降低（P < 0.05）。

2.2 14-脱羟-11，12-二脱氢穿心莲内酯对糖尿病大鼠胰腺组织形态的影响

正常组大鼠镜下可见胰岛丰富，呈圆形或类圆形，细胞质丰富，细胞核居中。模型组大鼠胰岛数目减少，形态不规则，细胞体积增大，细胞核偏心分布，有的有空泡变形的现象。高、低剂量组大鼠胰腺组织较模型组有明显改善，胰岛数目增多，形态较规则，细胞质增多。

免疫组织化学结果的判定：TNF-α主要在细胞质表达，胞质内出现棕黄色颗粒为阳性。正常组大鼠胰岛内TNF-α阳性细胞少，细胞质内棕黄色颗粒少，呈淡棕黄色，TNF-α几乎不表达；模型组大鼠TNF-α阳性细胞多，细胞质内深棕色颗粒多，表达呈强阳性；高剂量组与模型组比较，TNF-α阳性细胞明显减少，细胞质内棕黄色颗粒减少，表达呈弱阳性；低剂量组与模型组比较，TNF-α阳性细胞减少，细胞质内棕黄色颗粒减少，表达呈阳性。见图2。

3 讨论

胰岛β细胞是胰岛素合成、分泌的主要场所。因此，胰岛β细胞受损是1、2型糖尿病共同的病理变化[5]，而胰岛β细胞破坏的主要形式是凋亡。糖尿病时，对胰岛β细胞具有损伤作用的Th1型细胞及其细胞因子与具有保护功能的Th2型细胞及其细胞因子功能失衡。Th1型细胞因子主要指TNF-α、干扰素IFN-γ等分泌增多，其中，TNF-α具有广泛的生物活性，是最早启动炎症反应的因子之一，可影响糖脂代谢，诱导多种细胞因子的产生，直接或间接造成胰岛β细胞损伤，经多种途径影响DM的发生、发展。而DM的高渗状态又可引起TNF-α升高，高水平TNF-α又促进胰岛β细胞损伤，形成恶性循环，不断加重病情。TNF-α可通过与胰岛β细胞上的肿瘤坏死因子受体（TNFR1）结合，触发级联反应直接损伤胰岛β细胞[6]。同时，TNF-α可诱导胰岛β细胞内的一氧化氮合酶（NOS） 及一氧化氮（NO）表达增加，加快胰岛β细胞的凋亡[7]。

本实验采用STZ造模后，大鼠血糖明显升高，胰腺组织中胰岛数目减少，形态不规则，细胞体积增大，细胞核偏心分布，有的有空泡变形的现象。免疫组织化学结果显示，胰岛β细胞TNF-α表达增高。有研究表明，糖尿病大鼠模型中胰腺组织TNF-α可能直接作用于胰岛细胞凋亡[8]。本实验结果提示，STZ所致的糖尿病模型中，TNF-α参与了胰岛β细胞的损伤，使胰岛功能受损，胰岛素分泌减少，从而引起糖尿病。14-脱羟-11，12-二脱氢穿心莲内酯治疗后，高剂量组和低剂量组空腹血糖均下降，胰腺组织形态学改变较模型组减轻，胰岛β细胞TNF-α表达降低。

本实验的研究结果表明，14-脱羟-11，12-二脱氢穿心莲内酯可以降低胰岛β细胞TNF-α表达，与覃林花等[9]报道的穿心莲内酯能抑制活化巨噬细胞分泌TNF-α相一致。推测14-脱羟-11，12-二脱氢穿心莲内酯通过降低TNF-α的表达，减轻TNF-α介导的胰岛β细胞凋亡，减轻胰腺组织的损伤，从而起到降低血糖治疗糖尿病的作用。

[参考文献]

[1] 陈艳.穿心莲的化学成份及其制剂分析方法研究进展[J].医学信息，2009，22（9）：1968-1970.

[2] 李荣，肖顺汉.穿心莲的药理作用研究进展[J].四川生理科学杂志，2008，30（3）：131-133.

[3] 杨苹，韦昊，秦慧勤，等.穿心莲对正常小鼠和高血糖小鼠血糖影响的实验研究[J].时珍国医国药，2007，18（1）：87-88.

[4] 郭学军，邹移海，吴凌，等.链脲佐菌素诱导SD和Wistar大鼠糖尿病模型的影响因素[J].中国实验动物学报，2008，16（4）：301-304.

[5] Butler AB，Janson J，Bonner WS，et al. Beta 2 cell deficit and increased beta cell apoptosis in humans with type 2 diabetes [J]. Diabetes，2003，52（1）：102-110.

[6] Hui H，Dotta F，Di Mario U，et al. Role of caspase in the regulation of apoptotic pancreatic islet beta cells death [J]. J Cell Physiol，2004，200：177-200.

[7] Bruun JM，Roeske-Nielsen A，Richelsen B，et al. Sulfatide increases adiponectin and decreases TNF-alpha. IL-6 and IL-8 in human adiposetissueinvitro [J]. Mol Cell Endocrinol，2007，263（1/2）：142-148.

[8] 华坚，王欣，达琳.糖尿病模型胰岛细胞凋亡与多种细胞因子的相关性[J].中华保健医学杂志，2012，14（2）：109-111.

[9] 覃林花，郑智武，孔玲，等.穿心莲内酯对肿瘤坏死因子-α和白介素-12表达的抑制作用[J].第二军医大学学报，2011，32（7）：717-720.

（收稿日期：2012-12-25 本文编辑：程 铭）