瑞舒伐他汀对ApoE基因缺陷小鼠主动脉α―SMA表达的影响

摘要：目的 探讨瑞舒伐他汀对ApoE基因缺陷小鼠主动脉粥样硬化及α-平滑肌肌动蛋白（α-Smooth muscle actin， α-SMA）表达的影响。研究瑞舒伐他汀抗动脉粥样硬化（AS）降脂外的可能机制。方法 将20只6 w龄雄性ApoE基因缺陷小鼠随机分为两组：阳性对照组10只，予高脂饲料和饮水；瑞舒伐他汀组10只，予高脂饲料、饮水和瑞舒伐他汀10 mg/Kg/d； 另设同周龄野生雄性小鼠10只作为阴性对照组：予普通饲料、饮水喂养。三组小鼠喂养13 w后，摘出眼球并测定血清中总胆固醇（TCH）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL-C）的水平等生化指标。然后处死小鼠并取出主动脉（从主动脉弓起始到腹主动脉分支处），常规HE染色及免疫组织化学染色，观察主动脉形态学变化和血管壁斑块组织变化，定量分析斑块面积与管腔面积之比（PA/LA）、血管内膜厚度（IMT），定性分析α-SMA表达强度的变化。结果 6 w龄ApoE基因缺陷雄性小鼠喂养13 w后，与阳性对照组比较，瑞舒伐他汀组血清TCH、TG、LDL-C水平显著降低，两组差别有统计学意义；病理测定PA/LA及IMT，瑞舒伐他汀组较阳性对照组明显减小，差别有统计学意义；与阳性对照组比较，瑞舒伐他汀组血管壁组织α-SMA表达减少有统计学意义。结论 瑞舒伐他汀可减少动脉粥样硬化病变中α-SMA表达，其抗动脉粥样硬化降脂外作用可能为阻止血管平滑肌细胞向动脉粥样硬化斑块中迁移有关。

关键词：瑞舒伐他汀，ApoE基因缺陷小鼠，AS，α-平滑肌肌动蛋白

动脉粥样硬化（AS）是众多心脑血管疾病共同的病理生理基础，也是心血管系统疾病中最常见的疾病，严重危害人类疾病。目前他汀类药物已被公认为具有抗AS作用，越来越多的研究表明它在抗AS的形成和发展方面，除了降脂作用外还有很多调脂外的抗AS机制，如抑制血管平滑肌细胞（VSMC）的迁移和增殖。血管a-SMA属于细胞骨架微丝的基本成分之一，特异性的在VSMC中表达， 其相对含量是判断VSMC表型的重要指标。收缩表型细胞中主要以α-SAM为主，VSMC中α-SAM的减少提示细胞由收缩表型向增殖表型转化。本实验通过观察瑞舒伐他汀对AS板块中α-SAM表达的影响，进一步探讨其抗AS的降脂外作用。

1资料与方法

1.1药物和动物试验资料

1.1.1动物 健康野生型雄性小鼠10只，APOE基因缺陷雄性小鼠20只，体重18.5～21.1 g，购自南京医科大学实验动物中心。

1.1.2药物 瑞舒伐他汀，商品名可定，由阿斯利康制药有限公司提供。

1.1.3饲料 基础饲料及高脂饲料均由南京医科大学实验动物饲料厂提供。高脂饲料配方：10%猪油，2%胆固醇，0.2%胆酸钠，87.8%普通饲料。

1.1.4主要试剂及仪器 TC、TG、LDL-C试剂盒，由江苏建成公司生产。光镜病理试剂均由武汉博士德生物工程有限公司生产。ABC免疫组化染色试剂盒、日立7600-010全自动生化分析仪、日本欧林巴斯彩色病理图像分析系统。

1.2方法

1.2.1动物分组及处理 阴性对照组：6 w龄雄性野生型小鼠10只，给普通饲料、饮水喂养。将20只6 w龄APOE基因缺失雄性小鼠随机分为两组：阳性对照组10只，予高脂饮食、饮水；瑞舒伐他汀组10只，给予高脂饮食、饮水和瑞舒伐他汀10 mg/Kg/d。三组喂养时间均为13 w。

1.2.2样本采集 样本采集前12 h禁饮禁食，小鼠麻醉后，经眼眶取血，分离血清，测定血脂等生化指标。处死小鼠，取出主动脉（自主动脉弓至腹主动脉分叉处），生理盐水冲洗，4%甲醛中固定。常规石蜡包埋，从主动脉弓部起间断均匀切片，切片厚度为5 um，每只取5张切片。

1.2.3生化指标检测 血样送南京市第一医院生化室全自动数字生化分析仪测定血脂等。

1.2.4病理学测定 病理学测定在南京市第一医院病理科完成，每组随机取5个标本进行苏木素-伊红染色（HE染色），普通光镜观察形态学改变；每个标本取2张切片（每隔2张取1张）用纤维彩色图像处理，共计10个视野进行测量统计，测量指标包括：斑块面积与管腔面积之比（PA/LA）；血管内膜厚度（IMT）。每组选用五个斑块较明显的做统计分析。

1.2.5免疫组化 免疫组化在南京市第一医院病理科完成。检测通过ABC法染色，观察各组主动脉血管壁斑块组织α-SMA表达水平。

1.2.6统计学处理 本实验所检验变量均为连续性变量，且经SPSS的P-P图检验后均符合正态分布，故各数据以均数±标准差（x±s）表示，组间比较首先行方差齐性检验，方差不齐使用非参数检验（Kruskal Wallistest），方差齐采用方差分析。方差分析检验结果示各组间差异存在统计学意义后运用SNK法检验进行所有组间的两两比较。以α=0.05为检验水准，采用SPSS 17.0统计软件包对实验数据进行统计学处理。

2结果

2.1各组血脂结果 与阴性对照组相比，阳性对照组、瑞舒伐他汀TCH、TG及LDL-C均明显升高（P

2.2病理形态学改变及病理测定 阴性对照组小鼠动脉血管各层结构完整，内膜薄，由单层内皮细胞构成。阳性对照组内膜明显增厚，内含较多的泡沫细胞，VSMC向内膜突起。瑞舒伐他汀干预组较阳性对照组病变有明显较轻。见图1。

2.3小鼠主动脉α-SMA的表达 阴性对照组小鼠血管壁细胞浆内有黄褐色颗粒状物表达；阳性对照组血管壁及AS斑块表面胞质中有大量棕黄色颗粒，比阴性对照组表达更明显；瑞舒伐他汀组血管壁及AS斑块表面胞质中棕黄色颗粒较阳性对照组少，但比阴性对照组多，见图2。

3讨论

瑞舒伐他汀是一种新型、安全、高效、化学合成的最具成本效益比的剂效依赖性的他汀类降脂药物， 是目前降低LDLC作用最强的调脂药物。本实验结果显示与阳性对照组比较，瑞舒伐他汀组血脂水平显著减低（P

与阳性对照组比较，瑞舒伐他汀组小鼠的AS形态学改变、PA/LA及IMT均较阳性对照组明显减轻，进一步证明瑞舒伐他汀钙可产生抗AS作用， 减少动脉粥样斑块形成。阳性对照组动脉α-SMA表达明显高于阴性对照组， 差异有统计学意义， 提示α-SMA表达在AS的发病过程中起着重要的作用。瑞舒伐他汀钙干预组与阳性对照组相比α-SMA表达明显减少， 差异有统计学意义，提示瑞舒伐他汀抗AS的机制与减少动脉α-SMA表达有关。Mathapati S[1]实验表明高胆固醇饮食喂养的兔AS模型中主动脉粥样斑块中α-SMA的表达增加。Igarashi M[2]实验表明，在颈动脉内皮球囊剥脱的兔的AS模型中，HMG-CoA还原酶抑制剂 BAYw6228可以减少颈动脉新生内膜组织中α-SMA的表达、VSMC的增殖以及新生内膜的增厚。这些结果和本实验都是一致的。随着AS的发生，动脉壁的VSMC发生增殖和迁移，增殖型VSMC有很少的α-SMA表达，有理由推测，在本实验中AS斑块中发生了大量VSMC的迁移，正是这些迁移至AS斑块中的收缩型VSMC表达了α-SMA，而瑞舒伐他汀可以阻止VSMC向AS斑块中迁移，从而发挥抗AS的作用。至于瑞舒伐他汀是通过什么途径阻止VSMC向AS斑块中迁移的，暂且不甚明确，下面将设计新的实验进一步进行研究。

本实验进一步证明：他汀类降脂药抗AS机制中除了降脂作用外，还存在降脂外作用，抑制VSMC增殖及迁移是降脂外作用之一。瑞舒伐他汀具有降低血脂及减轻AS病变的作用，但与正常对照组相比，血脂水平仍偏高，仍存在AS病变，这说明在降低血脂及减轻AS病变的治疗中，我们不仅需要考虑药物的治疗作用，还需注意饮食、家族遗传的因素的影响。

参考文献：

[1]Mathapati S， Arumugam SB， Verma RS. High cholesterol diet increases MMP9 and CD40 immunopositivity in early atherosclerotic plaque in rabbits[J].Acta Histochem， 2010， 112（6）： 618-623.

[2]Igarashi M， Takeda Y， Mori S， et al. Suppression of neointimal thickening by a newly developed HMG-CoA reductase inhibitor， BAYw6228， and its inhibitory effect on vascular smooth muscle cell growth[J].British Journal of Pharmacology， 1997， 120： 1172 -1178.