泽泻萜类化合物对ApoE基因敲除动脉粥样硬化小鼠肝脏基底膜HSPG的调节作用

摘要：目的：观察泽泻萜类化合物对ApoE基因敲除小鼠实验性动脉粥样硬化肝脏基底膜硫酸乙酰肝素蛋白多糖的调节作用。方法：将8周龄C57/BL小鼠12只设为正常对照组，8周龄ApoE基因缺陷小鼠36只随机分为3组：模型组、中药组、舒降之阳性对照组。正常对照组、模型组予0.9％生理盐水灌胃，给药组正常人每kg体重的10倍量灌胃90天后，全自动生化仪测定血清血脂含量，用免疫印记法测定各组肝脏基底膜硫酸乙酰肝素蛋白多糖的表达，用Quantity One 6.0软件进行光密度分析。结果：中药组、阳性对照药组与模型组比较，总胆固醇、低密度脂蛋白水平均明显降低。中药组、阳性对照药组肝脏基底膜HSPG表达与模型组比较明显上调，但与正常对照组比较则明显下调。结论：泽泻萜类化合物对apoE-基因敲除高脂饲料喂养所致动脉粥样硬化小鼠具有降低血清总胆固醇、低密度脂蛋白的作用，对该模型小鼠的肝脏基底膜HSPG表达有调节作用。

关键词：中药学；泽泻萜类化合物；血脂；硫酸乙酰肝素蛋白多糖（HSPG）；动脉粥样硬化；ApoE基因敲除小鼠

中图分类号：R285.5文献标识码：A

文章编号：1673-7717(2007)04-0696-03

动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是心脑血管疾病的重要病理学基础，防止AS的发生及促使AS的消退是降低心脑血管病发病率和死亡率的根本措施。笔者在以健脾消痰化瘀为法的复方中药――以泽泻为主的降脂通脉方前期治疗高脂血症、动脉粥样硬化性疾病取得较好临床疗效基础上［1-2］，从整体动物水平进一步探讨泽泻萜类化合物调节C57/BL-apoE基因敲除小鼠血清脂质及泽泻萜类化合物对ApoE基因敲除小鼠实验性动脉粥样硬化肝脏基底膜硫酸乙酰肝素蛋白多糖的调节作用。

1材料与方法

1.1实验动物8周龄的健康雄性清洁级C57/BLApoE基因敲除小鼠及8周龄的健康雄性清洁级C57/BL小鼠，由北京医科大学动物所提供。北京医科大学动物所清洁级实验室寄养。

1.2实验药物泽泻萜类化合物，由北京中医药大学肖培根院士研究室提供。对照药：舒降之，杭州默沙东制药有限公司生产，生产批号：P1076。

1.3动物造模及分组C57/BLApoE基因敲除小鼠以高脂饲料喂养（高脂饲料的配制：含0.15％胆固醇，21％脂肪的高脂饲料，由北京科澳颗粒有限责任公司提供），复制动脉硬化模型。分为4组：①正常对照组：C57/BL小鼠，饲以普通饲料，同时0.9％生理盐水灌胃。②模型组：C57/BLApoE基因敲除小鼠饲以高脂饲料，同时0.9％生理盐水灌胃。③中药组：饮食同造模组，泽泻萜类化合物灌胃。④西药对照组：饮食同造模组，舒降之灌胃。

实验过程：将②、③、④组动物用高脂饲料喂养，同时中药组、西药对照组给予连续灌胃，给药方法：按正常人每kg体重的10倍量计算给药小鼠灌胃量，然后按每mL含10g小鼠灌胃量配制灌胃药液，按小鼠实际体重灌胃，每日给药1次，连续90天。

1.4观测指标及方法①血清脂质含量的测定：实验90天，小鼠空腹禁食（不禁水）12h后，在3％水合氯醛麻醉下进行腹主动脉取血（采血量1mL），2000r/min离心15min，分离血清。血清中胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）应用总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白试剂盒（中德合资北京利德曼生化技术有限公司）在自动生化分析仪测定。

②用免疫印记法测定肝基底膜 HSPG表达：实验90天，小鼠空腹禁食（不禁水）12h后，在3％水合氯醛麻醉下摘取肝脏。在冰冷匀浆缓冲液中匀浆，组织匀浆在16000g、4℃高速冷冻离心15min，留取上清，用lorry法测定组织液的总蛋白质的浓度。

含蛋白质50μg的样品进行SDSPAGE电泳将蛋白用半干法转移至硝酸纤维素膜5％milk/TBS溶液，轻摇30min，4℃封闭过夜弃去封闭液用TBS洗膜3次加入HSPG单克隆抗体于5％milk/TBS溶液中，加入0.05％tween-20 50μL，轻摇30min，孵育过夜弃去一抗，用TBS洗膜3次加入碱性磷酸酶标记的二抗于5％milk/TBS溶液中，轻摇30min，孵育过夜弃去二抗，用TBS洗膜3次用化学发光显影用Alpha imager 2200型凝胶成像仪（美国Alpha Innotech公司生产）将膜转化为数字映象用Quantity One6.0(BioRad Laboratory)软件进行分析HSPG表达。

1.5统计学处理各组间血脂结果均用（±s）表示，用方差分析。各组肝基底膜HSPG免疫印记的光密度值（±s），进行均值比较。

2结果

2.1各组实验性小鼠血脂的变化中药组血清TC值低于模型组，舒降之组血清TC值较模型组明显降低；中药组LDL明显低于模型组，舒降之组LDL值较模型组明显降低；HDL与模型组相比，差别无意义。见表1。

2.2肝脏基底膜HSPG表达

模型组肝脏基底膜HSPG表达明显低于空白组。中药组、西药对照组肝脏基底膜HSPG表达与模型组比较明显上调，但

3讨论

本课题组选用apoE-基因敲除小鼠高脂饲料喂养制造动脉粥样硬化模型。美国洛克菲勒大学生化遗传与代谢实验室和北卡罗莱那大学病理遗传实验室应用胚胎干细胞基因敲除（gene knockout）技术，于1992年培育成功载脂蛋白E（apolipoproteinE,apoE）基因敲除小鼠。ApoE是清除乳糜微粒和极低密度脂蛋白的受体的配体，因此，缺乏ApoE则会导致血液循环中富含胆固醇的物质积累而更加容易引起动脉粥样硬化的病灶形成。ApoE基因敲除小鼠无论正常或高脂饮食均可形成严重的高脂血症及AS病灶[3-4]，成为高脂血症及AS的发病机制和干预措施等方面研究的重要转基因动物模型。Sunny H Zhang等［4］研究发现，在普通饮食下ApoE基因敲除小鼠的血浆总胆固醇（TC）含量是正常水平的5倍左右。本课题组由于是ApoE-基因敲除小鼠高脂饲料喂养制造动脉粥样硬化模型，故血浆总胆固醇（TC）含量是正常水平的10倍左右，高于文献报道的总胆固醇水平。考虑与含胆固醇的高脂饲料喂养有关。

在肝脏清除乳糜残粒（CMRs）可以被在肝细胞的LDL受体所介导，另一途径是低密度脂蛋白相关蛋白（LRP），依赖细胞表面存在的HSPG，通过受体摄取，第3条摄取CMRs的机制就是HSPG本身［5］。CMRs清除地主要位点在肝脏，蛋白聚糖似乎参与了清除过程地几个步骤。①蛋白聚糖在肝脏地内皮表面以提供肝脂酶和脂蛋白脂酶。②Disse腔含有硫酸乙酰肝素蛋白聚糖可以结合肝脂酶和ApoE。CMRs分子进入此腔后，被这两个肝素结合蛋白相互作用所修饰。Disse腔在CMR被肝细胞所吸收前有储备和滤过功能［5］。有学者认为［6］，主要的蛋白聚糖位于Disse腔，肝脏的脂蛋白摄取的位点就是蛋白聚糖。有研究提示［7］：在糖尿病小鼠中，肝脏基底膜HSPG的减少是ApoB-48脂蛋白清除延迟，血清胆固醇和低密度脂蛋白升高的原因。故而HSPG在血脂代谢和动脉粥样硬化形成过程中具有重要的作用。

中医认为湿为水谷精微所化，过食肥甘，脾胃运化不利，聚湿生痰，导致脏腑功能障碍，脂肪代谢紊乱。泽泻，甘、淡，寒，归肾、膀胱经，功能利水渗湿，泄热。《本经》：“主风寒湿痹，乳难，消水，养五脏，益气力”。《本草纲目》：“渗湿热，行痰饮”《本草正义》：“……其兼能滑痰化饮者，痰饮亦积水停湿为病，惟其滑利，故可消痰。”现代研究［8］，泽泻有调脂、抗氧化，防治动脉粥样硬化的作用。

本实验结果表明泽泻萜类化合物对ApoE-基因敲除高脂饲料喂养所致动脉粥样硬化小鼠具有降低血清总胆固醇、低密度脂蛋白的作用，对该模型小鼠的肝脏基底膜HSPG表达有调节作用。

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