HPLC法测定丹参酮ⅡA磺酸钠原料的含量

[摘要] 目的:建立反相高效液相法测定丹参酮ⅡA磺酸钠原料含量的方法。方法:采用Luna-C18(4.6 mm×250 mm,10 μm)色谱柱;流动相:0.01 mol/L磷酸二氢钾-甲醇-三乙胺(35∶65∶0.5)(磷酸调节pH至5.5±0.1);检测波长:271 nm;流速:1.0 ml/min。结果:丹参酮ⅡA磺酸钠在0.10～3.00 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系(r=0.999 9)。结论:本方法简便、准确、重现性好,可用于丹参酮ⅡA磺酸钠原料的质量控制。

[关键词] 反相高效液相法;丹参酮ⅡA磺酸钠;含量测定

[中图分类号] R927.2[文献标识码] B[文章编号] 1673-7210(2010)03(c)-051-02

Content determination of sodium tanshinone ⅡA sulfonate by HPLC

TANG Nan1, ZHANG Dan2*

(1. Department of Pharmaceutical Analysis, Guangdong Medical College, Dongguan 523808, China; 2. West China Pharmacy School of Sichuan University, Chengdu 610041, China)

[Abstract] Objective: To establish a method for the content determination of sodium tanshinone ⅡA sulfonate by RP-HPLC. Methods: The Luna-C18 (4.6 mm×250 mm, 10 μm) column was used. The mobile phases consisted of phosphoric solution (0.01mol/L), methyl alcohol and triethylamine (35∶65∶0.5, adjusted to pH=5.5±0.1 with phosphoric acid), the flow rate was 1.0 ml/min and the detection wavelength was at 271 nm. Results: The linear ranges of sodium tanshinone ⅡA sulfonate was at 0.10-3.00 μg (r=0.999 9). Conclusion: The method is fast, reliable, accurate and can be used in the quality control of sodium tanshinone ⅡA sulfonate.

[Key words] RP-HPLC; Sodium tanshinone ⅡA sulfonate; Content determination

丹参酮ⅡA磺酸钠(sodium tanshinone ⅡA sulfonate)是丹参酮ⅡA经磺化而成的水溶性钠盐,它具有缩小心肌梗死面积、抗动脉粥样硬化[1]、降低心肌耗氧量、抑制血小板集聚及抗血栓形成[2]、抑制AngⅡ诱导的心肌肥厚[3]等作用,临床上常用于冠心病、心绞痛等症的治疗[4-6]。其含量方法有紫外分光光度法[7]、HPLC梯度洗脱法[8]等。本文建立了RP-HPLC等度洗脱法测定丹参酮ⅡA磺酸钠原料的含量,该方法操作简便、准确、快速,可为丹参酮ⅡA磺酸钠原料的含量测定提供检测方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器

日本岛津LC-10Atvp型高效色谱仪;Rheodyne 7725i型液相色谱进样器;美国Alltech公司 ChromTek色谱工作站;Cintra 10e型紫外可见分光光度计(澳大利亚)。

1.2 试药

丹参酮ⅡA磺酸钠对照品(含量:99.32%,四川大学华西药学院药化教研室);丹参酮ⅡA磺酸钠原料药(批号:031101, 031102,031103,四川大学华西药学院药剂教研室);甲醇为色谱纯(Dima公司);实验用水为超纯水;其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 测定波长的选择

精密称取丹参酮ⅡA磺酸钠对照品适量,加水溶解制成10 μg/ml的溶液,进行紫外扫描(200～400 nm)。由图1可见,丹参酮ⅡA磺酸钠在227 nm、254 nm和271 nm波长处有吸收峰,在271 nm波长处吸收最大,故选用271 nm为含量测定波长。

图 1 丹参酮ⅡA磺酸钠对照品UV图

Fig.1 UV of sodium tanshinone ⅡA sulfonate

2.2 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱:Luna-C18(4.6 mm×250 mm,10 μm);流动相:0.01 mol/L磷酸二氢钾-甲醇-三乙胺(35∶65∶0.5,磷酸调节pH至5.5±0.1);检测波长:271 nm。流速:1.0 ml/min;进样量:20 μl。丹参酮ⅡA磺酸钠峰与相邻杂质峰的分离度大于1.5。理论板数按丹参酮ⅡA磺酸钠峰计算应不低于2 000。色谱图见图2。

2.3 溶液的制备

2.3.1 对照品溶液的制备取丹参酮ⅡA磺酸钠对照品适量,精密称定,置50 ml量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀;精密量取5 ml,置25 ml量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀(操作均在避光下进行),作为对照品溶液。

2.3.2 供试品溶液的制备取本品约25 mg,精密称定,置50 ml量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀;精密量取5 ml,置25 ml量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀(操作均在避光下进行),作为供试品溶液。

2.4 线性关系考察

准确称取丹参酮ⅡA磺酸钠对照品12.5 mg,置25 ml量瓶中,加水稀释至刻度,制成0.5 mg/ml的对照品贮备液。准确吸取对照品贮备液0.1、0.5、1.0、1.5、2、2.5、3.0 ml分别置10 ml量瓶中,加水稀释至刻度,制成质量浓度分别为5.0、25.0、50.0、75.0、100.0、125.0、150.0 μg/ml的标准溶液,按上述色谱条件试验。以丹参酮ⅡA磺酸钠浓度X对峰面积Y进行线性回归,回归方程:Y=38 436.8X+6 385.6(r=0.999 9,n=7),结果表明丹参酮ⅡA磺酸钠对照品浓度与峰面积在0.10～3.00 μg范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验

精密吸取“2.3.1”项下对照品溶液(100 μg/ml)20 μl,重复进样5次,按上述色谱条件测定峰面积,测定色谱峰面积,RSD=0.20%,结果表明本法精密度良好。

2.6 稳定性试验

对同一样品溶液(批号:031101),在室温下于不同时间(1、2、3、5、8 h)分别进样20 μl,按上述色谱条件测定峰面积,测定色谱峰面积,RSD=0.23%,说明样品溶液在室温下放置8 h内基本稳定。

2.7 重复性试验

按“2.3”项下方法,以同一批样品(批号:031101)平行制备6份供试品溶液,按外标法分别测定含量(标示量%)及计算RSD。结果平均含量为99.96%,RSD=0.12%。结果表明本法重复性良好。

2.8 回收率试验

精密称取丹参酮ⅡA磺酸钠对照品6份,分别置50 ml量瓶中,再在各瓶中分别加入丹参酮ⅡA磺酸钠原料,加水稀释至刻度,摇匀;精密量取5 ml,置25 ml量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀,照含量测定项下方法测定。测得方法回收率为99.70%,RSD=0.80%。

2.9 样品含量测定

按“2.3”项下方法制备供试品溶液与对照品溶液,取供试品溶液与对照品溶液各20 μl分别注入液相色谱仪,记录色谱图;按外标法以峰面积计算。3批样品含量测定结果见表1。

表 1 3批样品含量测定结果(n=3)

Tab.1 The result of sample determination (n=3)

3 讨论

3.1 流动相pH值的选择

试验采用常规反相离子抑制色谱法测定,由于丹参酮ⅡA磺酸钠结构中含有酸性基团,在较低pH下可能抑制其解离,形成R-SO3H,使分子型增多,在反相柱上保留延长,而导致色谱峰拖尾。试验证实,当pH值调至5.5±0.1时,峰形较为对称。因此,最终确定流动相pH=5.5±0.1。

3.2 流动相中三乙胺的作用

丹参酮ⅡA磺酸钠结构中磺酸基团的硫原子与十八烷基硅烷键合硅胶上的残余硅醇基可形成氢键,使色谱峰拖尾,峰型展宽。若在流动相中加入适量三乙胺,可使其与药物的硫原子竞争残余硅醇基,大大减少硫原子氢键的形成,使峰型变窄。试验证实,未加三乙胺时,丹参酮ⅡA磺酸钠峰拖尾因子T为1.29,随着三乙胺加入量的增加,峰对称性逐渐增加,当三乙胺浓度增大到0.5%时,丹参酮ⅡA磺酸钠峰拖尾因子T为1.15,继续增大浓度对峰型并无明显改变,因此确定三乙胺的浓度为0.5%。

本实验进行了适度的强制降解试验来验证分析方法的专属性,包括酸解试验、碱解试验、高温试验、高湿度试验、强光照射试验、氧化试验。试验结果表明,主成分峰与杂质峰能达到基线分离,杂质对丹参酮ⅡA磺酸钠的含量测定没有干扰。因此,所建方法专属性较好。

[参考文献]

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(收稿日期:2009-11-20)