食用菌菌种分离与保藏方法

食用菌是一种纯培养，而在自然界中食用菌的发育繁衍过程中，又与其他众多的微生物混杂在一起。人们有目的地从中将特定品种食用菌的菌丝体单独分离出来，并在此基础上将获得的菌丝体进一步纯化，该过程就称为菌种分离。为了获得单一、纯度高的菌种，目前生产上常用的方法主要组织分离、孢子分离以及基内菌丝分离法等。现将该3种菌种分离方法及保藏方法总结如下。

1菌种分离方法

1.1组织分离法

组织分离法是通过切取菌索、子实体、菌核的新鲜幼嫩的组织进行分离，以获取纯菌丝的方法，是最常用的菌种分离法之一。子实体、菌索等实际上就是双核菌丝的纽结物，具有很强的再生能力。因分离时所选择的材料不同，该方法又可分为菌索组织分离法、子实体组织分离法及菌核组织分离法。在实践中，子实体组织分离法是最有效、最常用的方法。但对于胶质菌，由于其子实体中所含的菌丝量比较低，如黑木耳、银耳等，利用组织分离培养难度较大。组织分离属于无性繁殖的范畴，能保持原菌株的特性，遗传稳定变异小，不仅适于孢子不易收集或萌发的食用菌，也适于稳定优良品种的遗传性[1]。

1.2孢子分离法

孢子分离法，是采取子囊果或子实体中成熟的子囊孢子或有性孢子萌发成纯菌丝，再进一步培养成菌种的方法。由此法可以获得强活性、短菌龄的菌丝，该方法的另外一个优点是分离得到的有性孢子兼有双亲的遗传特性，可用于杂交育种和选育新种中。只是孢子间不仅存在个体差异，还存在较普遍的自然分化现象，出现的变异较大，必须经过出菇试验后才能用于生产中[2]。对于产孢子的真菌，一般其分离法多采用孢子分离法。

1.2.1种菇选择与处理。在选择种菇时，选取个体典型、大小适中均匀、健壮无杂且成熟度8成的子实体。将选好的种菇的杂物去除，并切除菇柄，用75%酒精抹擦菇体，或用0.1%升汞浸泡1 min（银耳、木耳类胶质菌的子实体只能用无菌水多次冲洗）。然后用无菌水冲洗种菇表面的残留药液。用无菌纱布拭干表面水分，并放入灭菌的器皿内备用。

1.2.2孢子采集。根据采集孢子的方法不同，又可分为以下几种。在用弹射法时，先安装已灭菌的孢子采集器，将经过处理的种菇菌褶朝下固定于三角架（采集器上）之上，扣上罩子，接着用0.1%升汞溶液润湿纱布并铺在培养皿的四周，既能防杂菌污染，又能增加罩内的湿度。最后再将整个采集器用灭菌的纱布覆盖，在适温漫射光条件下培养12~ 20 h，待孢子散出，选择在无菌的条件下将落有孢子的培养皿进行培养[3]。钩悬法是银耳、木耳等无菌柄类食用菌生产上常用的孢子采集法。取一金属针两头做成钩状，经火焰灼烧后一端固定于锥形瓶上，另一端钩住食用菌的子实体，塞上棉塞，于无菌环境中室温搁置约2 d，见瓶底有落下的孢子，即除去悬钩和子实体备用[4]。孢子收集的方法有很多，除了上述方法外，还有贴附法、印模法等。

1.2.3孢子分离。孢子分离有2种，分别为多孢分离和单孢分离，都是先收集孢子再经过分离选择，最终制成可供生产使用的菌种。其中多孢分离在生产使用较为普遍，如银耳、香菇、黑木耳等异宗结合的食用菌，它们的孢子有性别之分，单个孢子生产的菌丝无法结菇，因此需要把多个孢子接种在同一培养基上，发菌丝后自然，经挑选得到纯种，该操作简单易行。而蘑菇、草菇等孢子无性别区分，结实能力较强，单个孢子萌发即获得纯菌种。但生产上使用的食用菌同宗结合的种类相对较少，因此单孢分离多用于育种，生产上很少采用[5]。

1.3基内菌丝分离法

从食用菌生长基质中分离选择获得纯菌种的方法叫基内菌丝分离法。如可利用菇木、耳木、菌棒及土壤等作为分离材料进行分离。此法操作较复杂，但适宜不易采得子实体、错过子实体发生时期的菌类或胶质菌的菌种分离。使用此法时要特别注意，干燥耳木或菇木中的菌丝多处在休眠期。接种后有时需恢复25~30 d才能断定菌丝是否能恢复活性。

2纯化培养

菌种分离获得的菌丝体，经纯化后方能用于研究以及生产中。纯化的操作如下：若菌丝正常萌发，在洁白浓密菌落的生长前端挑取部分菌丝，接种于合适的培养基，并在室温下进行培养。如此移接2～3次后，纯化培养的目的即可达到。菌种纯化后的另一个重要工作就是做好菌种保藏[2]。

3菌种保藏方法

菌种保藏就是根据所保藏菌种的生理生化特性和遗传稳定性，人为地创造一个有助于休眠的环境条件，保持其稳定的性状。同时，还要保持菌种的纯培养状态，以使其免受到杂菌的污染。绝大多数菌种贮藏法都是通过人为的方式进行控制，最大限度地降低菌丝体的代谢强度，可通过低温、干燥、缺氧和饥饿等手段[6]。常见的方法有：一是矿油保藏法。为了有效地防止水分的蒸发，斜面培养物应用矿物油进行覆盖，同时还可起到隔绝空气的作用，进而降低细胞的生理代谢活动，该方法的储藏温度在15~25 ℃，可长时间地保藏菌种。二是继代培养保藏法，即斜面贮藏法。该方法是将菌种在低温4 ℃或室温中进行保藏，并定期进行转接的一种方法。三是干燥贮藏法。该法适于食用菌的孢子贮藏，是将孢子吸附在砂土、滤纸或硅胶等物体上进行长期贮藏，主要通过除去孢子细胞中的游离水使其代谢停滞并最终进入休眠状态。四是蒸馏水保藏法。该方法中保存食用菌菌丝体的溶液可选择缓冲液或蒸馏水或其他不含有机营养物的盐类溶液，对于绝大多数的食用菌菌种的保存均较为适合。有研究证明，真菌的保存液为蒸馏水时，储藏菌种的时间可达到1~20 年[7]。五是冷冻干燥保藏法，它是集干燥、低温和真空于一体的贮藏方法，广泛被菌种保藏机构所利用。该方法具有贮存方便、保藏时间长、成本低、 运输方便等优点，适于长期对孢子进行保藏[8]。

4参考文献

[1] 王卓仁.组织分离法在食用菌选择育种中的原则与实践[J].中国食用菌，2008，27（4）：12-13，44.

[2] 殷培峰.桑金钱菌的培养性状及其生理活性物质的研究[D].苏州：苏州大学，2005.

[3] 江微，杨江华，李川.食用菌菌种分离研究进展[J].农技服务，2009，26（7）：161-162.

[4] 胡昭庚.食用菌菌种分离制作与贮藏[M].北京：中国农业出版社，1999：77-78.

[5] 殷培峰，浦冠勤.野外药用真菌的菌种分离和保藏[J].滁州学院学报，2007，9（6）：68-71.

[6] 刘红，黄建军，许丽娟，等.谈食用菌菌种的保藏[J].现代农业科技，2008（18）：122-123.

[7] BORMAN A，SZEKELY A，CAM PBELL C，et al.Evaluation of the viability of pathogenic filamentous fungi after prolonged storage in sterile water and review of recent published studies on storage methods[J].Mycopatho-logia，2006，161（6）：361-368.

[8] 张瑞颖，胡丹丹，左雪梅，等.食用菌菌种保藏技术研究进展[J].食用菌学报，2010，17（4）：84-88.