黑曲霉淀粉酶酶学性质研究

摘要:本实验对黑曲霉JLSP-15淀粉酶的酶学性质进行了研究。该淀粉酶的最适温度为60℃,其热稳定性较差;最适pH为pH 6.0,在pH4.0-8.0范围内稳定性较好。Ca2+对淀粉酶活性具有显著促进作用,而Fe3+和Cu2+对其活性具有强烈的抑制作用。

关键词:淀粉酶 黑曲霉 酶学性质

淀粉酶是生物工艺学中最早实现工业生产的酶制剂品种,用途广,产量大。淀粉酶根据作用的方式可分为α-淀粉酶（EC 3.2.1.1）与β-淀粉酶（EC 3.2.1.2）[1]。α-淀粉酶是淀粉酶的一种,其作用于淀粉时,可从分子内部切开α-1,4 键而生成糊精和还原糖。α-淀粉酶作为一种重要的工业酶制剂,被广泛地用于食品,发酵,纺织,造纸业,制药业和化学药品工业等工业,此外还扩展到临床,医学,分析化学等其他领域。国内早期开发α- 淀粉酶主要来源来自细菌,其安全性与酶学特性限制其在食品工作中的应用。黑曲霉是美国FDA公布的40多种安全微生物菌种之一,可以产生蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等。

本研究以实验室分离的黑曲霉JLSP-15为菌种,采用固体发酵（SSF）获得黑曲霉淀粉酶,系统研究了其酶学性质。

1、材料与方法

1.1 菌种及固体发酵

黑曲霉JLSP-15为本实验室分离、鉴定。固体发酵培养基:新鲜麸皮9.5g,(NH4)2SO4 0.3g,KH2PO4 0.05g,(NH4)2SO4 0.15g,加入到250ml三角瓶中,再加入蒸馏水10.0ml,121℃灭菌。固体发酵条件:向灭菌后的固体发酵培养接入1ml黑曲霉JLSP-15菌种,30℃恒温培养60h。

1.2 淀粉酶酶活测定方法

在培养后的三角瓶中按1:20ml加入0.9%生理盐水,常温静置6h,然后过滤,滤液即为粗酶液。淀粉酶活性测定采用DNS法[2,3]。淀粉酶活力单位(U)定义为:在最适反应条件下,以每1min生成1μmol还原糖（以D-葡萄糖）所需的酶量作为一个酶活力单位。蛋白质浓度的测定采用Bradford法[4],牛血清白蛋白（BSA）为标准蛋白。

1.3 温度对淀粉酶活性的影响及其热稳定性

测定淀粉酶在30℃－80℃下的活性,以确定其最适温度。淀粉酶在30－80℃下分别保温5min,然后冰浴5min,在最适条件下测定酶活,以未经热处理的淀粉酶在最适条件下的酶活为对照,计算残余酶活,并计算其Tm值。

1.4 pH对淀粉酶活性的影响及其pH稳定性

淀粉底物分别用pH3.0－8.0的缓冲液配制,测定淀粉酶活性,确定其最适pH。将淀粉酶液pH分别调为pH3.0－8.0,在25℃条件下保温1h,然后在最适条件下（60℃、pH6.0）测定酶活,计算酶的存活率。

1.5 金属离子对淀粉酶活性的影响

分别向淀粉酶中添加Ca2+、Mn2+、Fe3+、K+、Cu2＋,各种金属离子的终浓度均为5.0mmol/L,在25℃下处理1h,淀粉酶残余酶活。

2、结果与分析

2.1 温度对酶活性的影响及其热稳定性

在30－80℃条件下,pH6.0条件下测定黑曲霉淀粉酶酶活,结果如图1。结果表明:该酶作用的最适温度是60℃,在45－65℃的范围内都保持70％以上的相对酶活力。热稳定性研究表明,淀粉酶在低于55℃下较稳定,Tm为60.2℃。在高于60℃条件下,淀粉酶活性稳定性迅速下降,80℃处理4min后,其残余酶活为1.0%。

2.2 pH对α-淀粉酶活性的影响及其pH稳定性

在不同pH条件下淀粉酶活性发生明显变化,在pH6.0时淀粉酶活性达到最大值。黑曲霉淀粉酶在酸性环境中活性较低,在pH3.0和pH9.0条件下,淀粉酶相对酶活分别为最适pH的1.05%和59.5%。pH稳定性研究结果表明,淀粉酶在pH4.0～8.0范围内较稳定,25℃,处理1h后其残余酶活均在80%以上。

2.3 金属离子对α-淀粉酶活性的影响

12种常见金属离子对米曲霉淀粉酶活性的影响各异。Ca2+对酶的激活作用显著,经1h处理活性是对照组的125.6%。Fe3+和Cu2+有较强的抑制作用,经1h处理活性分别是对照组的18.7%和31.2%。Mn2+对黑曲霉淀粉酶活性也有较大的抑制作用,经1h处理活性是对照组的65.6%。

3、结语

黑曲霉JLSP-15为本实验室从杭州植物园土样中分离并鉴定的淀粉酶高产菌株。该米曲霉淀粉酶的最适温度为60℃,最适pH为6.0,适合在较宽的碱条件下发挥作用。Ca2+对淀粉酶活性具有显著促进作用,而Fe3+和Cu2+对其活性具有强烈的抑制作用。系统研究该淀粉酶的相关酶学性质,可为其应用提供参考依据。

参考文献

[1]Elarbi MB, Khemiri H, Jridi T, et al. Purification and characterization of　α-amylase from safflower (Carthamus tinctorius) germinating seeds. Biologies, 2009, 332: 426-432.

[2]Miller G L, Blum R, Glennom W E, et al. Measurement of methods for assay of xylanase activity. Analytical Biochemistry,1959,2:127-132.

[3]郭勇.酶工程原理与技术.高等教育出版社,2005.9.

[4]Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anayticall Biochemistry,1976,72:248254.