黑曲霉外表基因表达

引言

食线虫真菌是植物寄生性线虫潜在的生物防治因子之一，对该类真菌侵染线虫的机制进行研究是构建高效生物防治菌和提高生防效率的基础。Dactylellinacionopaga(=Mona-crosporiumcionopaga，Dactylellacionopaga，Goloviniacionopaga)是一种产生黏性分枝的捕食线虫真菌。该菌对根结线虫Meloidogynejavanica具有很好的防治效果［1］，也能够防治胞囊线虫Heteroderaschachtii［2］。由于生长较快，与其他食线虫真菌相比更容易被开发成制剂［3］。目前关于产生黏性分枝的食线虫真菌的侵染机制研究鲜有报道。基因外源表达是鉴定基因功能的重要方法之一。D.cionopaga丝氨酸蛋白酶基因PrDⅠ经荧光定量PCR证明在该菌侵染线虫过程中表达量更高。本文通过对融合表达载体pGT21M进行改造，构建了含有组氨酸标签的黑曲霉表达载体，外源表达了D.cionopaga丝氨酸蛋白酶基因PrDⅠ。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株和质粒DactylellinacionopagaAS3.6776(SQ27－3)分离自云南三七根部土壤，为中国科学院微生物研究所真菌地衣系统学重点实验室保存。黑曲霉(Aspergillusniger)201和黑曲霉表达载体pGT21M由中国科学院微生物研究所真菌地衣系统学重点实验室唐国敏老师惠赠。

1.1.2试剂酶液:5～8mg/mlLysingenzyme(Sigma公司)，1mg/mlcel-lulaseR－10(日本Yakult公司)，0.8mol/LMgSO4缓冲液配制。Tris－HCl缓冲液:50mmol/L，pH7.5。限制性内切酶和T4DNA连接酶购自宝生物工程(大连)有限公司。化学试剂为分析纯，购自上海生物工程技术服务有限公司。硝酸纤维素滤膜和超滤管购自Millipore公司。His•BindColumn购自Novagen公司。改良的BCA蛋白检测试剂盒购自上海生物工程技术服务有限公司。

1.1.3仪器凝胶电泳系统(BIO－RAD，美国);紫外凝胶成像系统(BIO－RAD，美国);离心机(Sigma，德国);微量移液器(Gil-son，美国);梯度PCR仪(Biometra，德国)。

1.1.4培养基选择培养基:含有200μg/ml潮霉素的查氏培养基。发酵培养基:6%可溶性淀粉，2%酵母提取物，0.5%KH2PO4，0.5%玉米粉。1.2方法D.cionopaga丝氨酸蛋白酶基因PrDⅠ通过信号肽捕获技术克隆后测序(GenBankaccessionNo.JF699729)［4］。组氨酸标签以质粒pPICZαA为模板进行扩增，使用His－L(5'－tgt-gggcccaacgatgagatttccttc－3')和His－R(5'－cgagggccctcaatgat-gatgatgatg－3')为引物。将扩增产物连接至质粒pGT21M的ApaⅠ位点。应用NotⅠ酶切连接产物，通过连接酶使纯化的酶切产物的大片段发生自连，获得多克隆位点3'末端具有组氨酸标签的质粒pGT21M－HIS。以Pn－L(5'－cgaatcgatg-gcagaggaaggcgaaaagct－3')和Pn－R(5'－ggaatcgatagtggag-caagtcctgaggga－3')为引物，扩增丝氨酸蛋白酶基因PrDⅠ无信号肽编码序列的DN段，用ClaⅠ酶切后与同样酶切并去磷酸化的载体pGT21M－HIS连接，转化大肠杆菌(Esche-richiacoli)DH5α，构建丝氨酸蛋白酶基因PrDⅠ黑曲霉表达载体pGT21M－HIS－PrI。以Checkinsert(5’－tgcggccacatctgccat-tg－3’)为测序引物对该表达载体进行测序鉴定。黑曲霉的原生质体制备基本参照K.Wernars等人的方法［5］。黑曲霉原生质体的转化使用PEG－CaCl2介导的共转化方法。将转化子在选择培养基上分离纯化。采用CTAB法提取黑曲霉转化子基因组DNA，以Pn－L、Trp－R2(5’－ggc-cggatccaagaaggattacctctaa－3’)为引物，通过PCR反应鉴定整合了目的基因的转化子。D.cionopaga丝氨酸蛋白酶基因PrDⅠ在黑曲霉细胞中的转录用RT－PCR进行检测，以进行了DNA消化的总RNA为模板，引物为Pn－L和Pn－R。将鉴定的转化子与原宿主菌同样活化后接种于发酵培养基中，通过SDS－PAGE和蛋白平板活性检测筛选转化子。初筛样品1次重复，于发酵4d、6d后取发酵上清进行检测。复筛样品3次重复，分别于培养3d、4d、5d、6d、7d和8d后取发酵液进行SDS－PAGE和蛋白平板活性检测。蛋白酶酶活平板测定方法如下:配制0.1mol/L柠檬酸－磷酸钠缓冲液(pH7.0)。将100ml缓冲液分为两份，在其中50ml缓冲液中加入1g琼脂糖煮沸，放至55℃水浴保温。同时，将另外50ml缓冲液加热至55℃，然后将0.5g酪蛋白(ca-sein)缓慢溶于其中。将两份溶液混合后倒培养皿。测定酶活时，在casein平板上用打孔器(Ф=4mm)打小孔，加入30～50μl酶液，30℃恒温静置，观察有无透明圈形成。当制备pH5.0蛋白平板时，用2%脱脂奶粉代替酪蛋白。大量发酵黑曲霉转化子，进行重组蛋白的分离纯化。过滤发酵液除去菌丝体，依次用饱和度为25%和80%的硫酸铵溶液分级沉淀上清中的蛋白质，10000g离心。将沉淀重悬于Tris－HCl缓冲液中，然后对50mmol/LTris－HCl缓冲液进行透析除盐，使用BaCl2检测透析效果。应用0.4μm硝酸纤维素滤膜过滤透析液，获得丝氨酸蛋白酶粗酶液。重组蛋白通过亲和层析进行纯化。粗酶液的上样与洗脱遵循His•BindColumn说明书进行。每500μl洗脱液收集一管，用超滤管脱盐并浓缩样品。对纯化的酶液进行SDS－PAGE和蛋白平板活性分析。

2结果与分析

黑曲霉能够分泌大量内源蛋白。为了方便目的蛋白外源表达后的分离纯化，在黑曲霉表达载体pGT21M的多克隆位点下游插入了组氨酸标签。经测序鉴定证明构建了具有HindⅢ、BstBⅠ、ClaⅠ、HpaⅠ、NotⅠ、XbaⅠ克隆位点的载体pGT21M－HIS。将丝氨酸蛋白酶PrDⅠ前肽编码序列插入pGT21M－HIS的ClaⅠ位点，酶切和测序结果均显示构建了该基因的融合表达载体pGT21M－HIS－PrI，载体图谱如图1所示。通过原生质体共转化，将pGT21M－HIS－PrI导入部分内源蛋白酶基因敲除的黑曲霉菌株201，获得共转化子164个。随机选取潮霉素抗性菌落，用PCR方法鉴定了含有目的基因的转化子39个(图2A)。收集发酵2d的黑曲霉菌丝体，提取总RNA，进行RT－PCR检测，鉴定目的基因是否转录的结果表明，转化子Pn7b、Pn11、Pn140转录了目的基因(图2B)。培养经过PCR鉴定的转化子，转化子初筛的SDS－PAGE分析结果表明，与对照相比转化子发酵液泳道具有微弱的蛋白差异条带。蛋白平板活性检测结果显示，在pH5.0蛋白平板上转化子发酵液具有蛋白水解活性。复筛结果证明了，发酵4d的转化子目的蛋白表达量较高。另外，用液氮研磨破胞，应用SDS－PAGE及pH5.0和pH7.0蛋白平板检测转化子胞内蛋白酶的表达量及其活性。结果表明，在SDS－PAGE凝胶上不能确定有目的条带出现，转化子和对照之间无明显的蛋白表达和蛋白酶活性差异。进行转化子的大量发酵，采用硫酸铵沉淀、亲和层析和超滤纯化浓缩发酵上清200倍，应用SDS－PAGE和蛋白平板检测纯化产物。结果表明，纯化产物在SDS－PAGE凝胶分子量约为45kDa处具有目的条带(图3)，获得的酶液在pH5.0蛋白平板上30℃条件下温育过夜，显示出了蛋白水解活性(图4)，而在pH7.0蛋白平板上无水解圈出现。改良的BCA蛋白浓度检测结果表明，纯化后酶液的蛋白浓度为30μg/ml。

3讨论

丝氨酸蛋白酶是食线虫真菌重要的侵染相关蛋白之一。目前已经从食线虫真菌中至少分离纯化了16种丝氨酸蛋白酶。酶学、免疫学和基因表达研究证明，它们分别在捕食真菌(ArthrobotrysoligosporaPΠ和Aoz1、D.cionopagaDcp等)、内寄生真菌(HirsutellarhossiliensisHasp和Hnsp、Verticilliumsuchlas-poriumP32和V.chlamydosporiumVCP1)和卵寄生真菌(Lecani-cilliumpsalliotaeVer112、PaecilomyceslilacinuspSP－3和PIP、ClonostachysroseaLmz1和PrC)对植物寄生性线虫的侵染过程中发挥作用［4，6，7］。利用丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶抑制剂处理A.oligospora明显影响了该菌对线虫的侵染［8］。在A.oligospora中表达多拷贝丝氨酸蛋白酶PⅡ基因，可以增加侵染结构的数量，提高该菌对线虫的致病力［9］。V.suchlasporium丝氨酸蛋白酶P32在侵染过程中定位于被侵染线虫的卵上［10］。电子显微镜观察结果显示，分离纯化的H.rhossiliensis丝氨酸蛋白酶能够改变线虫体表形态［7］。对食线虫真菌的丝氨酸蛋白酶及其基因进行结构和功能分析是构建生物防治因子工程菌株的重要理论基础。D.cionopaga丝氨酸蛋白酶基因PrDⅠ具有信号肽，编码胞外蛋白，在该菌侵染线虫过程中高表达，推测的氨基酸序列与其他食线虫真菌蛋白酶高度同源，与从D.cionopaga中纯化的丝氨酸蛋白酶Dcp的N－端序列不同［4］。该基因及其编码的丝氨酸蛋白酶的结构和功能有待于研究。由于在食线虫真菌中往往存在多种丝氨酸蛋白酶同功酶，从细胞发酵液中纯化蛋白然后进行结构和功能分析受到了蛋白量和特异酶鉴定可重复性的限制。进行基因外源表达是解决该问题的途径之一。目前建立的基因外源表达系统包括昆虫杆状病毒表达系统、大肠杆菌表达系统、芽孢杆菌表达系统、链霉菌表达系统、极端嗜盐古菌表达系统、酵母表达系统、丝状真菌表达系统、哺乳动物细胞表达系统和植物表达系统。在各种外源表达系统中，大肠杆菌表达系统和酵母表达系统常被用于丝状真菌基因的外源表达。大肠杆菌表达系统具有表达量高的特点，但是表达的外源蛋白往往以包涵体的形式存在，而且不能够对表达的蛋白进行翻译后修饰。应用酵母表达系统可以进行外源基因的胞外和胞内表达，该表达系统也能够对表达的蛋白进行糖基化修饰。Clonostachysrosea丝氨酸蛋白酶Lmz1［11］和H.rhossiliensis丝氨酸蛋白酶Hasp在毕赤酵母(Pichiapastoris)中均已获得了外源表达，并且重组蛋白表现出了蛋白水解活性［7］。然而，我们对D.cionopaga蛋白酶基因PrDⅠ进行毕赤酵母外源表达时，SDS－PAGE检测结果显示，该基因不能在以BMMY为诱导培养基培养的毕赤酵母GS115中获得胞外表达。黑曲霉遗传背景清晰，具有较强的分泌胞外蛋白的能力，能够分泌大量淀粉酶，长期用于食品和药物的工业化生产，被认定为安全的生产菌株［12－14］。黑曲霉表达系统是主要的丝状真菌表达系统之一，黑曲霉表达系统的建立为丝状真菌基因外源表达获得成功提供了更大的可能。报道的外源基因表达量能够达到微克级到克级［15－18］。然而，目前可用的黑曲霉表达系统还很有限［19－21］。就我们检索的文献，至今还没有应用含有组氨酸标签的分泌表达载体在黑曲霉中进行成功外源表达的研究报道。在本研究中，使用由pGT21M改造的载体，将D.cionopaga可能与侵染机制相关的丝氨酸蛋白酶基因PrDⅠ转入糖化酶高产菌株黑曲霉201中进行了外源表达。D.cionopaga丝氨酸蛋白酶基因PrDⅠ序列分析表明，该基因推测的前肽理论分子量为39.84kDa，成熟肽理论分子量为28.90kDa。然而，D.cionopaga丝氨酸蛋白酶基因PrDⅠ在黑曲霉201中外源表达的重组蛋白经SDS－PAGE分析证明分子量约为45kDa，说明目的重组蛋白在表达后进行了翻译后修饰。该现象与丝氨酸蛋白酶基因PrDⅠ序列的翻译后修饰位点分析结果和A.oligosporaPΠ黑曲霉表达结果的报道相一致［4，22］。A.oligospora天然PΠ蛋白的分子量为40kDa，而在黑曲霉AB1.13pclA和AB1.18中外源表达的重组蛋白的分子量为48kDa［22］。重组表达的PΠ在抑制剂类型、底物谱和最适pH反应上与天然蛋白无明显差异。D.cionopaga天然的PrDⅠ的动力学特性还有待于研究，以与重组蛋白的性质相比较。在本研究中，黑曲霉表达的外源蛋白在酸性条件下具有活性，与大多数碱性蛋白酶的主要活性范围不同，该反应特征可能也与蛋白质经翻译后修饰的结果有关。M.Ward等报道使用黑曲霉糖化酶N－末端编码序列进行外源基因的融合表达可以增加目的蛋白的表达量［23］。本研究应用的载体的母质粒黑曲霉表达载体pGT21M在多克隆位点上游具有黑曲霉糖化酶基因启动子和N－端编码序列，在下游具有色氨酸终止子，能够引导外源基因进行胞外融合表达。刘丽等用pGT21M母质粒pGT10大量表达了细菌血红蛋白［24］。张金祥等应用融合表达载体pGT21M和非融合载体pGT进行基因外源表达的结果显示，以pGT21M构建的转化子表达外源蛋白的量较低，但是比活力较高［25］。本研究使用改造的pGT21M进行了丝氨酸蛋白酶基因的融合表达，与木聚糖酶B相比，外源基因表达量较低［15］。以非融合载体pGT构建D.cionopaga丝氨酸蛋白酶基因PrDⅠ表达载体将可能能够提高该基因在黑曲霉中的外源表达量。作为蛋白分泌表达的重要宿主，黑曲霉中与错误折叠蛋白分泌压力相关的基因转录与翻译反应已被分析［26］。N.S.Dunn－Coleman等报道，应用筛选模型对含有目的基因表达载体的黑曲霉突变子进行筛选，可能能够获得外源蛋白分泌量达到克级的转化子［27］。然而，本文筛选的转化子胞内蛋白检测结果初步显示了，对获得的转化子进行突变难以进一步增加外源蛋白的分泌表达量。本研究使用的黑曲霉菌株为胞外蛋白酶部分敲除菌，进一步构建蛋白酶缺陷宿主或根据蛋白分泌压力相关基因优化宿主将可能改善黑曲霉表达体系的外源表达量［28］。G.M.Eibes等证明，通过优化发酵条件能够提高A.nidulans转化子的外源表达量［29］。虽然该策略在过氧化物酶的黑曲霉表达中没有发挥作用，但是在其他基因的黑曲霉表达中，改变发酵条件可能将提高特异外源蛋白的表达量。D.cionopagaPrDⅠ黑曲霉转化子的发酵条件有待于进一步优化。

4结论

本研究构建了含有组氨酸标签的黑曲霉表达载体。利用该载体获得了D.cionopaga丝氨酸蛋白酶基因PrDⅠ黑曲霉转化子，应用亲和层析进行外源表达蛋白的大量制备，将能够对该酶结构和功能进行进一步的研究。虽然目前应用该黑曲霉表达系统可能获得的蛋白表达量较低，需要依赖下游的大量发酵获得足量蛋白，但是D.cionopaga丝氨酸蛋白酶基因PrDⅠ的黑曲霉外源表达显示了，该表达系统在真菌基因外源表达量和活性上相对毕赤酵母表达系统具有优势。对于内源表达量低的酶和转化体系没有建立的真菌来说，采用黑曲霉表达系统进行外源表达为蛋白及其编码基因的功能研究提供了可能。对于那些具有重要生物功能和经济价值的基因资源，黑曲霉外源表达系统为其应用提供了一条重要途径。